蛇毒影响凝血系统毒素的鉴定

早在蛇咬伤的治疗中，蛇毒对凝血系统的影响就引起了人们的重视。蛇毒对凝血系统影响的研究，不仅促进了蛇毒药理学和毒理学的发展，也促进了凝血机制研究的发展。凝血“瀑布学说”的建立也与蛇毒对凝血系统影响的研究密切相关。

蛇毒对血液凝固系统的作用不仅有促凝和抗凝作用，还有溶纤作用。凝血和纤溶是一对相反的生理过程，在体内形成精密的生物调节系统，维持正常的血液循环。然而，蛇毒中不同的毒素或成分，对凝血和纤溶的各个步骤的影响几乎是不同的。

一、蛇毒促凝成分鉴定

(1) 类凝血酶测定的生物学方法

许多精氨酸酯水解酶具有凝血酶样活性。上述方法均为酯酶检测方法，对类凝血酶的检测特异性不强。因此，要确定具有酯酶活性的酶是否也具有凝血酶样活性必须通过一些生物学方法来证实。

本方法是用反应板法或试管法测定凝血活性。使用反应板时，在0.05mol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲液中配制0.5%人纤维蛋白原，取0.2ml于反应板孔内，加入待测酶液0.1ml，记录形成情况纤维蛋白原纤维蛋白丝的时间是根据纤维被细玻璃棒挑起所需要的时间来计算的。使用试管法时，取上述纤维蛋白原溶液0.5ml置于小试管中，加入待测酶溶液0.1ml，记录纤维蛋白原溶液浑浊凝固的时间。酶活性单位是通过与已知的凝血酶活性单位比较来确定的（Sato，1965）

(2) 复制大鼠静脉血栓模型（李福贤等，1982）

蛇毒中含有多种成分，可以去除动物身上的血栓。为了模拟体内效果，需要复制动脉和静脉血栓。

肌肉注射4%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定在动物手术台上，在腹部正中线切开皮肤约3cm，从白线切开腹膜，Reyers按压等人的方法。稍好转，分离下腔静脉，在左肾静脉下方用粗细线结扎下腔静脉，缝合腹壁。结扎2小时后，重新开腹，在结扎处下方2cm处用止血钳夹住血管，吸出该段管腔内的血液，然后纵向切开管腔，观察有无是血栓形成。如果已经形成血栓，将血栓取出，放入真空干燥器中晾干。 24小时后，称取栓子重量，计算血栓形成百分率，作为判断药物疗效的指标。

(3) 复制大鼠动脉血栓模型（李福贤等，1982）

将大鼠麻醉，固定方法同上，然后按Hladovee法和Vigdakl法进行改良。一侧颈总动脉剥开15mm长，用一小块塑料布盖住伤口附近的组织，防止组织温度影响血管壁表面温度。用不锈钢电极轻轻提起动脉段，用1.5mA直流电刺激7.5分钟。每个不锈钢电极的直径为1.3mm，两个电极之间的距离为1.5mm。刺激前先用半导体点式温度计测量颈总动脉远端的表面温度，然后进行刺激。刺激后60分钟内，每2分钟测量一次颈总动脉远端表面温度，绘制温度曲线。如果动脉中的血流因血栓形成而受阻，使动脉血无法通过阻塞处流向头部，则远端温度突然下降。从刺激开始到温度突然下降的时间即为闭塞时间（OT），可作为判断药物疗效的指标，做动脉形态学检查与正常的。

上述复制动静脉血栓模型的给药方法如下：按组剂量，结扎下腔静脉或颈总动脉电刺激前1小时，从股静脉缓慢注入，完成10分钟内完成注射。对照组注射等体积的生理盐水。

(4)纤维蛋白凝块结构电镜观察(关立峰等，1985)

根据Kay (1967) 等稍作修改。将0.1ml 人纤维蛋白原(5mg/ml) 与0.1ml 人凝血酶溶液(40 NIH units/ml) 或TLE (150fxg/ml) 混合，滴一滴混合物到碳涂层铜网格上，放置在室温下或在37X3下放置一定时间后，用几滴生理盐水清洗铜网，再用3滴1%醋酸双氧铀染色，用蒸馏水清洗，吸掉多余的用滤纸加水。铜网风干后，放入电子显微镜下观察凝块结构。

(5) FPA（纤维蛋白肽A）和FPB（纤维蛋白肽B）样品的制备（关立峰，1985）

蛇毒中的凝血酶样酶可以水解纤维蛋白原，产生FPA 或FPB。这两种肽的测定方法如下：将纤维蛋白原冻干粉溶于pH7.40.05mol/LTris-HCl缓冲液中，终浓度为5mg/ml，加入人凝血酶或蛇毒TLE后，反应a一定时间，然后放入沸水浴中，中温加热2分钟，使纤维蛋白沉淀，离心分离沉淀的蛋白，再高速（10000Or/min）离心，取上清液用于高效液相色谱分析。