蛇毒 膜毒素

1.一级结构

膜毒素的一级结构相似，含有8个半胱氨酸和4对二硫键。由于有8个半胱氨酸，分子可分为8个区域： 第一个区域包含2个氨基酸，通常是Leu和Lys；第二区含有10~11个氨基酸，通常为10个氨基酸，不同来源的毒素之间的同源性非常大；第三区含有6个氨基酸，同源性很大；第四区含有16个氨基酸，不同来源的毒素在该区差别很大；第五个区域包含3 个氨基酸，分别是Ile、Asp 和Val。在短链神经毒素中，该区域为1个氨基酸，在长链神经毒素中为3个氨基酸，因此膜毒素的该区域与长链神经毒素相似；第六个区域，含有10个氨基酸，具有较大的同源性；第7区，含4个氨基酸，同源性高；第八区为1个氨基酸，均为Asn。

膜毒素具有大约25 个疏水氨基酸，而短链神经毒素具有少于20 个疏水氨基酸。膜毒素的疏水性氨基酸PrO、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe和Trp。此外，膜毒素还含有大量的赖氨酸、少量的苏氨酸和极少的精氨酸，净正电荷为610个，而短链神经毒素的净正电荷数为34个。类型的神经毒素具有三个结构不变的氨基酸TrP29、Arg37和Gly38，而膜毒素在相应位置不具有这些氨基酸。对于膜毒素，结构不变的氨基酸是8 个半胱氨酸和Gly2。 （长链神经毒素的第20位也是Gly），Arg43（短链神经毒素的第43位也被认为是结构保守的氨基酸。还有一些次要的不变氨基酸，其中一些起到决定毒素结构特异性的作用。有些可能起功能作用。膜毒素有20个不变氨基酸，神经毒素有2223个，膜毒素比神经毒素保守突变位点。突变和神经毒素毒素相似，长度变化在膜毒素中更为严格，进化不会像神经毒素那样产生长链膜毒素。Cys3和Cys17之间可以有10到11个氨基酸，这是一个区域长度可变，长链毒素中该区域的氨基酸数量最多可增加或减少3个，膜毒素中不变氨基酸的分布与神经毒素明显不同。膜毒素在Cys3~Cys17之间有3个不变氨基酸，而短链神经毒素在该区域只有一个不变氨基酸Ser8。 Membranotoxin在9~13这个区域含有一个非常疏水的五肽，其中Prow是一个不变的氨基酸。 Cys17~Cys24氨基酸残基之间有6个不变氨基酸，其中4个为不变氨基酸Gly2。它也是长链毒素中的不变氨基酸。对于神经毒素，几乎所有的功能不变氨基酸都在Cys24~Cys45之间的这个区域，而膜毒素只有两个结构不变的氨基酸，Arg43和：1744，在这个区域；该区域膜毒素与短链神经毒素的长度相似；膜毒素这一区域的氨基酸是极性的。这两个区域与神经毒素相似，氨基酸残基数目相同，Cys49~Cys61在两类毒素中都是疏水性的，这两个区域在两类毒素中都起到维持结构的作用。

关于膜毒素与细胞的作用有两种学说，一种是膜毒素通过静电力与细胞膜结合，毒素的疏水突起插入细胞膜，从而破坏细胞膜的结构。如果这个理论是正确的，那么Toxinr 的必需正电荷基团必须由不变氨基酸Lys12 或Lys44 提供，疏水突起必须是Pro8 周围的疏水五肽。从眼镜蛇舟山亚种蛇毒中分离出一种类似于真心毒的毒液

同源心脏毒素，但毒性极小。西姆等人。 (1986)分析了该毒素外露的二环和三环，发现有5个氨基酸与真正的心脏毒素相同，这部分可能是毒素与受体相互作用的部位。

对膜毒素的研究很多。根据Joubert 等人的说法。 (1980)，到1980 年为止，已经确定了42 种膜毒素及其类似物的一级结构。

2. 化学修饰对毒性的影响

膜毒素的化学修饰不多，所以积累的资料也很有限，这里只是简单介绍一下。

(―) 二硫键的修饰

强等人。 (1975) 是第一个对中国眼镜蛇毒液中的心脏毒素进行化学修饰的人。二硫键的还原和丙烯腈的烷基化可以改变心脏毒素的免疫学特性和生物学活性，这种处理完全改变了毒素的原始构象。关于二硫键对膜毒素结构的重要性没有太多争论。除了Keimg之外，其他学者也做过类似的研究，结果与Keung得到的结果相同。黄等。 (1978) 还发现还原的二硫键被重新氧化成桥，只有能够建立原始构象的氧化产物才能恢复完整的生物活性。为了减少构象变化的幅度，Tonsing 等人。 (1983)在NT-V'4(Nmm)的二硫键中插入一个原子形成S—Hg—S型。结果，该毒素失去了心脏毒性和与心肌细胞竞争的能力。

(2) 羧基的修饰

膜毒素除C端外只有1-2个侧链羧基。当Iwaguchi 等人。 (1974)将一些膜毒素的羧基部分酯化，毒素的圆二色性和活性保持不变；完全酯化后，还剩下25% 的活性。拉默温等人。 (1978)利用核磁共振(NMR)研究膜毒素的结构，发现C端羧基可能与R36的侧链形成盐键，并推断侧链羧基不是很对MT 的活动很重要。

(3)氨基的修饰

分子中的Lys除膜毒素N端氨基外，还含有氨基。帕特尔等人。 (1969) 使用二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-C1) 修饰细胞毒性混合物P6(Nn)。凝胶过滤分离后，得到50%裂解活性的荧光部分，在显微镜下观察。看到荧光鸡红细胞侵袭的全过程。杜玉仓等。用纯CT-I(Nn)重复上述实验，未发现上述现象。在进一步纯化DNSized CT-I时，由于无法去除大量的混合试剂，单一的DNS-CT细胞毒性在10%以下。很难用与细胞膜相互作用的基本上无活性的分子令人信服地代表MT 的作用过程。然而

(四）对精氨酸的修饰

膜毒素一般只含一个精氨酸残基(R38)«CarlSS0n等（1980)先用1,2-环己二酮对膜毒 素CT-V"(Nha)改性，然后用羟胺去掉此保护基，并对去掉此保护基后复原产物和改性膜 毒素进行纯化。圆二色谱研究结果指出，虽然改性MT的肽链走向变化不大，但酪氨酸状 态似有影响，生物活性下降到26%后再复原到78%。由于R88残基是膜毒素与神经毒素的 共有残基，所以倾向于R88是活性不必需的，因为神经毒素没有膜毒素的活性，但化学修 饰可能造成R88不再能与C-端羧基形成盐键，使得R88-I41的B折叠的位置稍有移动，从而 影响了疏水内核中酪氨酸或色氨酸的状态。

(五）对酪氨酸的修饰

对酪氨酸的修饰工作做得相对较多的Keung等(1975)在无变性剂存在下，用4倍摩 尔数的四硝基甲烷对心脏毒素进行修饰，结果2个Tyr被硝基化，第3个Tyr显然在分 子内部，只有在5mol/L盐酸胍的存在下才能被修饰。这种被硝化的毒素仍具有沉淀抗血 清的功能，破坏艾氏腹水癌细胞的毒性受到轻微的影响。正常毒素在lO^g/ml的浓度下 与上述癌细胞作用80min有50%的细胞被破坏;3个Tyr都被硝基化的毒素在同等条件 下只有25%癌细胞被破坏;2个Tyr被修饰的毒素破坏癌细胞的能力为37%。3个Tyr 中有1个不变氨基酸Tyr25，另外2个是可变氨基酸。硝基化的膜毒素仍能够与抗血清反 应，说明其构象未变，这样的衍生物应该仍具有毒性。心脏毒素比62-4型神经毒素对硝基 化修饰要稳定得多，因为对62-4型的神经毒素中的2个Tyr进行硝基化后其毒性下降较多。四硝基甲烷修饰动力学的结果表明各位置上的酪氨酸所处环境不同，反应能力依 次为Y25>Y23>Y53，Y23被修饰后，12B(Hh)的致死毒性(LD5。)不变，但如继续加深硝化 则毒性及溶血活性皆明显下降。然而圆二色谱分析表明，即使3个酪氨酸全部硝化，MT 肽骨架构象被干扰也不明显。台湾眼镜蛇膜毒素的结构似更紧密，它的Y53残基深埋内 部。与上述3种毒素或者它自己的Y12和Y23都不同，Y58被滴定时PK>11(Y12和Y28为 pO. 6)，如没加变性剂(6mol/L盐酸胍)不能被硝化。2个酪氨酸被硝化(Y12及Y28)的产 物保留70%的致死毒性和溶血活性以及与反应前相同的圆二色性，一旦Y53亦被硝化，则 毒性下降到30%，而圆二色谱显示此衍生物已是几乎完全松散的肽链了。一级结构与此 相近的印度眼镜蛇毒中的CT- I (Nn)硝化后抑制吉田肉瘤细胞的活性只留下7%左右， Karol等(1兆4)对几种膜毒素中的Tyr残基外露情况进行了研究，发现Tyr2^ Tyr5^ 化学试剂敏感性较小，Bougis等(1983)对膜毒素W (Nnm)进行碘化，发现Y12残基是最暴露的，被碘化后毒性也无变化。Galat等研究了眼镜蛇 Wra)心脏毒素在水溶液中加氟乙醇或SDS时对分子折叠与松散的影响。在这种情况下， 心脏毒素的二硫键不受影响，但2种试剂都能影响心脏毒素的结构，而且都是可逆的。氟 乙醇对心脏毒素结构松散作用的可逆性大小与氟乙醇的浓度有关，SDS不能影响二级结 构，但可以影响其三维结构。如果SDS的浓度达到形成微粒的临界浓度，心脏毒素的结构 又恢复到类似自然状态。折叠与松散可能与分子之间的相互作用有关。一般地说，如果膜 毒素的空间结构确实相互差别不大的话，它们内部的酪氨酸残基的化学稳定性肽节结构 的紧密度及毒性三者应有某种平行关系，即Y52>Y23>Y25>YU。这个看法与从NT类比 而来的印象(即Y23埋藏最深，与活性关系也较大)是很不相同的。

(六）对甲硫氨酸的修饰

Carlsson等（1978)选用N-氯代琥珀酰亚胺代替反应不够专一的溴化物，滴定毒素 V"1 (Nm)，看到它仅有的2个硫醚基都是暴露型的，如都被氧化，膜毒素的圆二色谱变化 很小，仍具免疫活性，表明这2个残基不包括在膜毒素的抗原决定簇内，但M26及M28氧化 修饰的产物已丧失了全部溶血和致死毒性，Tonsing等(1983)发现它竞争结合细胞膜的 能力也只有17%。另外，CT-m (Nna)和CT-M (Nns)及CT-W(Nns)在全部氧化后也完 全失去使肌肉挛缩的能力。Hung等(1977)用CNBr处理MT，能从中段失落一个FM二 肽，缺二肽的MT衍生物是失活的，但仍保留70%免疫活力。总之，暴露在分子表面的 M26和M28对膜毒素的毒性是极重要的，它们可能通过疏水键与受体结合，但肽节4与分 子抗原性无关。

(七）化学合成

化学合成对弄清分子的结构以及某种残基的功能十分有效，但往往不易合成。台湾眼 镜蛇毒素CTX- BI (Nna)和印度眼镜蛇毒中的CT- I (Nn)等膜毒素已经分别用固相法和 片段固相缩合法合成。从无规则结构的合成肽链氧化成与天然毒素结构和活力都相同的 蛋白质证实了二硫键对稳定MT构象的重要性。杜雨苍等(1985)在合成MT-Dl(Nna)时 故意对换了          第48位和49位残基的位置，最后合成产物的生物活性与MT-D1无差别，证 明该位置上保守性变异(L48与V49)是膜毒素功能允许范围内的变化。

三、高级结构

膜毒素的晶体结构研究进展缓慢，主要是因为不易得到适合于X射线衍射用的单晶 体。曾经对眼镜蛇如知)蛇毒中的心脏毒素进行了广泛的结晶探索，但只得到低分 辨率的、部分有序度的晶体，难以进行深入的结构分析。后来有报道蛇 毒心脏毒素W的晶体质量较好，已获得2. 7nm分辨率的晶体结构，人们将会很快看到第 一个精确的细胞毒素的空间结构图像。有关膜毒素的高级结构，杜雨苍(1988)作了非常详 细的综述，读者可参考这部分内容，这里不再叙述。