蛇毒中L

（一、概述

L-氨基酸氧化酶与蛇毒中的其他酶不同。它不是水解酶，而是催化L-氨基酸脱氢的酶，其产物是相应的酮酸。大多数蛇毒含有L-氨基酸氧化酶，该酶具有很高的活性。当以亮氨酸为底物时，某些蛇毒中的L-氨基酸氧化酶活性比哺乳动物高400倍。因为这种酶含有辅基FAD，呈黄色，蛇毒的黄色大部分是由这种酶产生的。白蛇毒一般不含L-氨基酸氧化酶。例如Snake和Snakefish的蛇毒是无色的，它们不含L-氨基酸氧化酶。也有例外。比如我国的蕲蛇虽然毒液是白色的，但是它有这种酶。

L-氨基酸氧化酶的分布很广。大多数眼镜蛇、蝰蛇科和响尾蛇的蛇毒都含有这种酶。这种酶在眼镜蛇毒液中的含量比较少。大约4% (W/W) 的海蛇毒液中，没有发现这种酶。

L-氨基酸氧化酶催化L-氨基酸的产生-酮酸蛇毒中的L-氨基酸氧化酶在体系中存在过氧化氢酶的情况下催化上述反应，当体系中没有过氧化氢酶时进行如下操作：

0

二

R—CH—C00H+H20+02—»R—C—C00H+NH3+H202(2)

我

氨气

反应分为两步：第一步是L-氨基酸脱氢生成中间体，脱去的氢转移给FAD；第二步中间体与水反应自动生成a-酮酸，转移到FAD上的氢与氧结合生成过氧化氢。

FAD+R—CH—COOH—^[R—C—COOH]+FADH2(1)

三

nh2nh

o

[R—C—COOH]+HzO——R—C—COOH+NH3(2)

二

氨氮

fadh2+o2——h2o2+fad

没有过氧化氢酶时，生成的过氧化氢不能及时消除，容易与酮酸反应使其氧化。有过氧化氢酶时，过氧化氢分解成水。

(2)分离及理化性质

L-氨基酸氧化酶的纯化及理化性质研究较多。 Piscivorus）毒液L-氨基酸氧化酶的纯化，黄绿铁头蛇毒液L-氨基酸氧化酶的纯化，并对其理化性质进行了研究。最早的L-氨基酸氧化酶晶体是由Wellner和Meist-ter(1960)从东部小菜蛾的毒液中纯化L-氨基酸氧化酶得到晶体。

蛇毒中的L-氨基酸氧化酶具有许多共同的性质，如分子量在60000140000之间，大部分都含有FAD辅基等。下面以从蛇毒中分离得到的L-氨基酸氧化酶为例进行研究。插图。

从蛇毒中分离出的L-氨基酸氧化酶由两个非共价键合的亚基组成，每个亚基的分子量近7万，整个分子的分子量约为13万，含糖5%。每个分子都有两个FAD 辅基。该酶可呈晶体悬浮于水中，也可呈浓溶液存在于0.1mol/L KCl或0.1M TriS-HCl(pH7.2)缓冲液中。这些存在方式在0~5条件下可保存数月而不影响活性，但冷冻干燥会使酶失活。取决于pH 值和离子强度。失活伴随着可见吸收光谱的变化，但不会引起聚集，也不会解离成亚基，仍然保留对抗体的反应能力。大多数情况下，失活的酶在pH 5.0下加热可恢复活性，光吸收也会恢复正常，因此失活可能是酶构象发生微小变化所致。 很可能是由FAD 修复组的变化引起的。从沙蝰毒液中分离的L-氨基酸氧

氧化酶也有这个特性（Kunh，1976）；从蛇毒中分离出的L-氨基酸氧化酶已通过多种物理方法结晶并确定为纯品，但通过电泳或离子交换层析可将其分离为三部分。具有相同活动的组件；从巴勒斯坦毒蛇毒液中分离出的L-氨基酸氧化酶也具有相同的特性。虽然出现这种现象的原因尚不完全清楚，但推测这三种异构酶的形成是因为不同的亚基以不同的方式结合而成。组成L-氨基酸氧化酶的两个亚基具有相似的氨基酸序列，但电泳速度和N端氨基酸残基不同。构成L-氨基酸氧化酶时，两个亚基的数量也不同，一个亚基约为另一个亚基的2.5倍。等电聚焦电泳可将这种酶分解成更多的组分，每一个组分都具有酶促活性。为了解释这一点，已经设想了几种可能性：一种假设是异构现象是由于分子中酰胺基因的数量和位置的差异，这种情况类似于许多细胞色素c；另一种假设是，它是由分子中糖含量不同引起的，类似于核糖核酸酶的异构化；还有一种假说认为是分子构象不同造成的，类似于线粒体中苹果酸脱氢酶的异构化。一般来说，L-氨基酸氧化酶是一种分子结构差异不大的同工酶混合物，造成这种现象的原因有待进一步研究。从眼镜王蛇毒液中分离出的L-氨基酸氧化酶与上述酶不同。由于酶是通过层析得到的，不可能用常规的离子交换将其分成几个组分，而是酶处于分子筛层中。分析还显示对称的蛋白质峰，与酶活性峰重合。该酶在高pH体系聚丙烯酰胺凝胶电泳和平板梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳中均呈单一条带，即使在等电聚焦电泳中，在pH4.1较细的条带下也仅出现2~3条带，而从C. viper分离出的L-氨基酸毒液氧化

该酶在等电聚焦电泳中显示2-3条或更多条带。显然，这两种酶之间存在很大差异。无论凝胶电泳行为、分子量和亚基分子量如何，眼镜王蛇毒液L-氨基酸氧化酶都表现为单一成分。它仅显示等电聚焦电泳过程中分子电荷的微观不均匀性。是一条蛇

Ueda等（1.988)从烙铁头(T.蛇毒中分离纯化出一种L-氨基酸氧化酶，用凝胶过滤测定分子量为40 000,用SDS-PAGE测定分子量为70 000,这说明该酶 由两个相同的亚基组成。这种酶的等电点为5. 4,含有两个FMN辅基，它水解疏水氨基酸 速度较快，对碱性氨基酸的水解速度较慢。在PH7. 6条件下水解Leu的Km和V_„ait分别 为1. 17mmol/L和9. 9u/mg。酶的活性可以被重金属离子(Zn2+、Cd2+和Hg2+)和巯基修 饰剂(如KCN、PCMB和碘乙酰胺)抑制，这说明该酶中的活性部位有巯基存在。这种现象和从 蛇毒中分离的L-氨基酸氧化酶相似，该酶中含有4个自由巯基。

分子中含FMN的L-氨基酸氧化酶不多，哺乳动物组织中提取的酶含有这种辅基。在 蛇毒L-氨基酸氧化酶中，另一个含FMN辅基的是从 蛇毒中分 离的L-氨基酸氧化酶，有趣的是这两种蛇的亲缘关系较近。比较从V.  、C.和眼镜王蛇蛇毒中分离的L-氨基酸氧化酶的氨基酸组成可以发现，它们都含 有较多的酸性氨基酸。但也存在着较大的差别，例如眼镜王蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶没有 色氨酸和甲硫氨酸，赖氨酸的量也多于精氨酸；对于C.蛇毒中这种酶而言，

情况正相反。在氨基酸组成比例中，眼镜王蛇L-氨基酸氧化酶的酸性氨基酸含量也比响 尾蛇蛇毒的酶含量多，而碱性氨基酸的含量则比响尾蛇来源的酶低，这 一情况与眼镜王蛇蛇毒的L-氨基酸氧化酶等电点低于响尾蛇毒来源的酶是一致的。对于 L-氨基酸氧化酶的等电点而言，似乎没有什么规律可以遵循，例如从和T. //azwwW

从C. a心肌狀蛇毒中分离的L-氨基酸氧化酶的光谱吸收性质与条件有关，但大 致吸收峰变化不大。这个酶在275nm、390nm和462nm显示3个特征吸收峰。这个结果 和眼镜王蛇毒L-氨基酸氧化酶吸收光谱几乎相同，眼镜王蛇蛇毒的特征峰为276nm、 392nm和465nm。它们与FAD特征吸收峰265nm、375nm和450nm比较，表明这些L-氨 基酸氧化酶都含有FAD辅基，但FAD与蛋白质结合后，450nm、375nm和265nm的Xmax 向长波方向移动了近3nm。由于FAD在265nm吸收与蛋白质280nm吸收峰叠加，至使 L-氨基酸氧化酶在280nm处的消光系数远大于一般简单蛋白质，同时使酶紫外吸收 向短波方向移动2nm〜3nm。