蛇毒蛋白的分离技术 等电聚焦凝胶电泳

（-）原则

蛋白质分子是典型的两性电解质分子，在大于其等电点的pH环境中离解成带负电的阴离子，并迁移到电场的正极，在低于其等电点的pH环境中离解成带正电的离子等电点。带电的阳离子向电场的负极迁移。这种游动只有在pH值等于它的等电点的环境中，即蛋白质所带的静电荷为零时，才能停止。如果将含有各种等电点的混合蛋白样品在pH梯度环境中进行电泳，那么在电场的作用下，不管这一大群混合蛋白分子的原始分布如何，每个蛋白分子都会根据各自的等电性。电点的大小聚集在pH梯度的相应位置。经过一定时间后，不同的蛋白质成分被分离到不同的区域。这种聚集是根据等电点的大小在相应的pH梯度位置进行的。这种行为称为聚焦。等电聚焦是一种特殊的电泳方法。其特殊之处在于，它是利用一种叫做两性电解质原载体的物质，在电场中形成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品聚焦，从而达到分离的目的。

所谓两性电解质载体，实际上是许多异构体和同系物的混合物，其化学本质都是聚羧基聚氨基脂肪族化合物，分子量在300-400之间。商品名有“Ampholine”（瑞典LKB公司产品） )、“Pharmalyte”(瑞典Pharmacia公司产品)等。在直流电场的作用下，它们可以形成平滑连续的pH梯度，从正极到负极pH值逐渐增加。该pH 梯度的稳定程度极大地影响了两性电解质的聚焦。在聚焦过程中，扩散是一个破坏性因素，尤其是在去除外电场后，可以破坏两性电解质载体形成的pH梯度，使聚焦分离的样品组分重新混合。要消除这种破坏性因素，就需要加入抗对流的支持介质。最常用的抗对流支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。

凝胶等电聚焦一般是指使用聚丙烯酰胺凝胶作为抗对流支持介质的等电聚焦。这种电泳法的特点是两性电解质载体由于直流电场的作用，在凝胶柱或凝胶板中产生pH梯度。如果在凝胶柱中产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱的某一部位时，该部位的pH值恰好等于蛋白质的等电点，就会聚焦一个蛋白质区形式。只要测出焦点的pH值，就可以知道蛋白质的等电点。

由于凝胶等电聚焦法消除了扩散的影响，延长电泳时间使被测物质更浓，区带更窄，从而提高了分辨率。与一般电泳法受扩散影响，随着电泳时间的延长越来越宽的情况相比，这是一个很大的优势。凝胶等电聚焦法不仅可以测定两性电解质的等电点，还可以分离或鉴定等电点不同的混合物质。

（二）操作方法

主要仪器：8根双通玻璃管（内径0.6cm，长10cm）；塑料玻璃管架； 1个50M1微型注射器； 7号注射针1根（长4cm）； 1根10cm长的注射针；分析平衡；电泳仪（300V）；台灯；圆盘电泳槽；鸭嘴镊子1把（夹件用）； 1把镊子； 1 个凝胶柱支架（黑色）。

材料胰凝乳蛋白酶（生化试剂，上海生化所产品），需配成10mg/ml水溶液测定。试剂

15%（W/V）凝胶储备液（15%丙烯酰胺-0.4%亚甲基双丙烯酰胺溶液）：称取15g丙烯酰胺和0.4g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺于蒸馏水中定容至100ml，滤去不溶物，置将其装在棕色瓶子中，然后存放在冰箱中以备后用。

0.004%（W/V）核黄素溶液： 称取核黄素（又称维生素B2，生化试剂）4mg，溶于100ml蒸馏水中，置于棕色瓶中。使用前准备。

10% (W/V) TEMED溶液： 取10mg TEMED，加90ml蒸馏水，置于棕色瓶中，冷藏保存。

1%（W/V）TEMED溶液：取10%TEMED溶液10ml，加蒸馏水90ml，置于棕色瓶中，冷藏保存。

5% (W/V) 过硫酸铵溶液： 在使用前准备好。

两性电解质载体：Ampholine（pH3.510），含量40%（瑞典LKB产品），冷藏保存。

0.01mol/LH3PO4 溶液。

0.02mol/L NaOH 溶液。

10% (W/V) 三氯乙酸溶液。

脚步

聚焦凝胶柱：的制备首先是混合凝胶。在25ml 烧杯中，按以下配方配制10ml 凝胶溶液：

光聚合凝胶配方：15%凝胶储备液5ml、40%安倍啉0.5ml、1%TEMED溶液0.5ml、蒸馏水1.5ml、0.004%核黄素溶液2.5ml。

化学聚合凝胶溶液配方凝胶储备液5ml、40%Ampholine 0.5ml、10%TEMED溶液1ml、蒸馏水3.4ml、5%过硫酸铵溶液0.1ml（最后加入）。

以上两种凝胶溶液配制好后，用玻璃棒轻轻搅拌使其混合均匀。由于化学聚合反应速度快，当加入5%过硫酸铵并用玻璃棒快速轻柔搅拌时，必须立即配管（注意：为除去抑制聚合的氧，最好混球瓶中加入胶水，并进行减压泵送处理。对于化学聚合胶液，加入5%过硫酸铵前需进行减压泵送处理，本实验省略此步骤，不影响实验效果） .

接下来，装载试管和样品。将8根干燥、清洁、经洗液处理过的双通玻璃管（内径0.6cm，长10cm）竖直插在塑料玻璃管架上。玻璃管的底端必须紧紧地贴在橡胶塞上，以确保底端封闭。 8根玻璃管分为两组，4组装光聚合胶液，4组装化学聚合胶液。用滴管取凝胶溶液，沿玻璃管内壁缓慢滴加。当每根玻璃管的凝胶溶液加到近1/2管长时，用微量进样器加

再次，聚合。①将4支装有光聚合凝胶液的玻璃管在常温、垂直条件下用40W台灯光 照聚合约1. 5min。②将4支装有化学聚合凝胶液的玻璃管在常温、垂直条件下静置聚合 约 20min。

电泳:将凝胶管的水封端向上，垂直插入圆盘电泳槽装置内，下槽加0. 02mol/L NaOH溶液，轻轻敲动凝胶管以除去NaOH溶液与凝胶界面之间的气泡。用滤纸条吸除 凝胶管上端的水封层后，上槽加0. Olmol/L磷酸溶液，使凝胶管上端的空隙内完全充满 磷酸溶液，如有气泡须用针头或玻棒轻轻挑除。两组凝胶管要作好标记以便区别。

上槽接正极，下槽接负极。打开直流电源，恒压160V，聚焦约7h。当电流接近零时即 停止电泳。

剥胶:聚焦以后取下凝胶管,先用蒸馏水将凝胶管两端洗3次，再用带有长针头的 注射器内装蒸馏水进行剥胶。操作同聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。以凝胶柱的正极端为 “头”，负极端为“尾”，在“尾”部插上塑料三角标签。三角标签应预先编上号码，使光聚合凝 胶柱同化学聚合凝胶柱相区别。若凝胶柱的正极端和负极端不易分清，可用pH试纸检 定，酸性端是正极端，碱性端是负极端。

量出固定前的凝胶柱长度:将凝胶柱平放于胶柱托板(黑色)±.用尺量出每一根 凝胶柱的长度，并记录下来。

固定:每组凝胶柱各取3根，即光聚合凝胶柱取3根，化学聚合凝胶柱取3根，分 别置于培养皿内，加入10%三氯乙酸溶液直至将凝胶柱盖没，固定过夜。一般在2h以后 即可看见凝胶柱内蛋白质白色沉淀区带。

测定pH梯度:取试管架2只，每只试管架上各插上18支试管，每支试管内加入 lml蒸馏水。将未经三氯乙酸溶液固定过的光聚合凝胶柱1根平放在玻璃板上，按照从正 极端(酸性端)到负极端(碱性端)的顺序用刀片依次切成5mm长的小段，共18段,分别置 于          第一组试管架上的18支装有lml蒸馏水的试管中，浸泡过夜。将另一根未经三氯乙酸 溶液固定过的化学聚合凝胶柱作同样的处理，并将所切成的18段分别置于          第二组试管架

上的18支装有lml蒸馏水的试管中浸泡过夜。

次日用pH试纸测出每一支试管内浸泡液的pH值，并按照每一组试管的顺序记录下 来。

量出固定后的凝胶柱长度和聚焦部位至正极端的距离;将固定过的凝胶柱平放于 胶柱托板(黑色)上，用尺量出凝胶柱的长度以及凝胶柱的正极端（酸性端)到蛋白质白色 沉淀区带中心即聚焦部位的距离，记录下来。

(三）数据处理

pH梯度曲线的制作以凝胶柱长度(mm)为横坐标，pH值为纵坐标作图可得到 一条pH梯度曲线。由于所测得的每一管的pH值是以5mm长为一小段的pH混合平均 值，因此在作图时可以把这个pH值视为5mm小段中心区的pH值，于是          第一小段的pH 值所对应的凝胶柱长度应为2. 5mm，          第二小段的pH值所对应的凝胶柱长度为 (5X2 —2. 5)mm,由此类推，          第n小段的pH值所对应的凝胶柱长度为（5n — 2. 5)mm。

蛋白质样品等电点的求算

按下列公式计算蛋白质聚焦部位距凝胶柱正极端(酸性端）的实际长度（以心表示）：

Lp = Lp' X

式中，LV表示所量出的蛋白质白色沉淀区带中心距凝胶柱正极端的长度，L表示凝 胶柱固定前的长度，"表示凝胶柱固定后的长度。

根据蛋白质聚焦部位距凝胶柱正极端的实际长度/w>，从pH梯度曲线上查得的 某一 pH值就是该蛋白质的等电点。

试比较用光聚合凝胶柱和化学聚合凝胶柱进行聚焦所测定出的等电点值。