蛇毒蛋白的分离技术 亲和层析技术

一、原理

亲和层析是一种专一、高效的纯化和分离生物分子的层析方法。生物体内的大分子化合物具有与其结构相对应的特定分子可逆结合的特性，如抗原-抗体、激素-受体、酶-底物或抑制剂等，这种结合往往具有特异性和可逆性。生物分子之间的这种结合能力称为亲和力。尝试将一种具有结合亲和力的物质吸附或结合在凝胶上作为固定相，称为配体，另一种物质作为流动相，即样品。当混有其他杂质的样品通过含有配体的凝胶时，样品物质与其配体结合并保留，其他杂质被洗掉，然后改变洗脱液的条件，如pH，以分离样品物质。洗脱出来得到分离纯化。

亲和色谱中最常用的生物系统如下：

酶： 底物类似物、抑制剂、辅酶。

抗体： 抗原、病毒、细胞。

凝集素： 多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞。

核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，结合蛋白。

激素和维生素： 受体，载体蛋白。

Cell : 细胞表面特异性蛋白，凝集素。

亲和层析的优点是操作简便，条件温和，柱效高。对含量极少、不稳定的活性物质的分离特别有效。甚至可以通过亲和层析从粗提物中纯化几个步骤。百倍到千倍。例如，分离胰岛素受体时，以胰岛素为配体，与琼脂糖载体偶联，肝细胞提取物中的胰岛素受体经亲和层析纯化高达8000倍。

亲和层析的局限性在于并非所有的生物聚合物都具有特定的配体，需要针对某一分离对象制备特定的配体并选择特定的色谱条件。

由于琼脂糖作为理想载体的出现和固定化技术的改进，亲和层析技术得到越来越广泛的应用，发展十分迅速。目前已有上百个成功实例，也有亲和层析技术作为亲和层析使用。承运商的商品供应。因此，亲和色谱已成为生物化学中分离纯化生物活性物质的重要方法之一。

二、载体的选择

亲和层析的成功首先在于载体的选择。一个理想的载体应该具备以下特征：

不溶，这是载体的最低条件。

它具有高效的疏松多孔网络结构，可以让大分子自由通过，从而提高配体的有效浓度。

良好的机械性能和适当的粒度，良好的流动特性。

非特异性吸附应尽可能小，作为惰性载体。

具有大量可活化的化学基团。

具有良好的物理化学稳定性，能承受配体固定和亲和层析可能使用的各种条件（如pH、离子强度、温度、变性剂、去污剂等）。

能抵抗微生物和酶的破坏。

具有高度亲水性。

这里有几点需要说明。 首先，大分子化合物的结合度是有效配体浓度的函数，尤其是当配体与大分子之间的亲和力较低时。因此，载体必须具有许多在温和条件下可用的特性。配体结合位点。一旦这些部分被配体取代，它们也很容易被大分子化合物接近，因此载体也必须具有多孔结构。孔隙率不是决定性因素仅在两种情况下： 第一种是待纯化的大分子与配体之间的色谱亲和力非常高时，载体表面有限数量的结合位点足以将所有大分子化合物合并。第二种情况是色谱结合化合物的分子太大，甚至无法放入非常大的网孔载体中，如分离多核小体、膜碎片、细胞器和完整细胞时的情况。其次，目前可用作生物亲和层析的载体有：纤维素、SMDA-Sepharose、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚苯乙烯、交联共聚和物理包埋、多孔玻璃等。目前，常用的载体只有琼脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖和多孔玻璃，其中以琼脂糖最为常用。因此，下面的描述主要针对琼脂糖，其他的只是笼统的提及。

(1) 纤维素及其衍生物

纤维素是制备固相酶和免疫吸附剂的常用载体，也是最早用于亲和层析的载体。纤维素具有价格低廉、来源充足、操作方便等优点，但由于其纤维状、不均质的缺点，蛋白质大分子难以穿透，非特异性吸附也很严重，因此纤维素制备的吸附剂往往未经亲和层析纯化，活性恢复不理想。由于小分子配体衍生物比大分子配体更容易受到纤维素的位阻干扰，因此小分子纤维素衍生物的分离效果不如大分子配体衍生物。

(2) S-MDA树脂

淀粉用高碘酸盐氧化生成淀粉二醛，再与4,4-二氨基二苯基甲烷缩合，最后用席夫氏碱还原生成S-MDA树脂。

(3) 葡聚糖凝胶

Sephadex是由聚葡萄糖环氧氯丙烷交联而成的产物。珠状凝胶以商品名Sephadex 出售。具有良好的化学和物理稳定性，但其孔隙率低于琼脂糖凝胶，且在偶联配体作用后，凝胶的溶胀度会进一步降低，因此在亲和层析中的应用也受到一定的限制.

(4) 乙烯与马来酸酐的共聚物(MEA)

乙烯与马来酸酐（MEA）的共聚物在国外已实现商业化生产。该共聚物结合酶（Trypsmchy-motrypapainsubfilopeptidaseA.B）后，商品名为Enyite-EMA，该产品酶含量高达60%。

Gdldstein 等人。 Friy 等人研究了与EMA 载体结合的酶的特性。用水解酶研究抑制剂，再用抑制剂研究水解酶。

(5) 聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶的理化性质非常稳定，抗微生物侵蚀的能力比琼脂糖强

叠氮衍生物通过聚丙烯酰胺的酰基经水合肼处理后形成酰肼基，再由亚硝酸处 理而成叠氮基衍生物。它可以和具有脂族或芳香族氨基的配基偶合。

氨基衍生物带有酰胺基的聚丙烯酰胺衍生物可与脂族二胺反应制得氨基衍生 物。它可以和带羧基的配基偶合。利用脂族二胺中的烃长度可以控制“手臂”的长短。

酪氨酰衍生物聚丙烯酰胺叠氮衍生物进一步和甘氨酰酪氨酸反应可制得酪氨 酰衍生物，它可以和带有氨基的配基经重氮化合相偶联。

(六）多孔玻璃及其衍生物

在固相酶中出现的多孔玻璃也已被应用于亲和层析作为载体，烷基胺取代的多孔玻 璃商品名为Bio-Glass，多孔玻璃的优点在于不受微生物的侵蚀，经得起有机溶剂与缓冲 液组成的改变。但是，玻璃表面对蛋白质也具有非专一吸附，而且所制得的吸附剂只依靠 表面作用，因而它的广泛应用还有待更多的研究。

(七）琼脂糖及其衍生物

琼脂糖是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间结合的链状多糖，琼脂糖已制成珠状凝胶颗粒，商品名瑞典称为Sepharose(Pharmacia)，美国称Bio-gel A,中国称琼脂糖凝胶(Agarose gels)。琼脂糖凝胶为珠状凝胶，是固体膨胀状态,混悬于 水中含有0. 02%的叠氮钠作为防腐剂，有如下3种型号:Sephar0se 6B，含有6%的琼脂 糖浓度，颗粒大小为40Mm〜210ftm，分离范围105〜106分子量;Sepharose 4B，含有4%的 琼脂糖浓度，颗粒大小为40/nm〜190)um，分离范围为3X105〜3X106分子量;Sepharose 2B，含有2%的琼脂糖浓度，颗粒大小为60fxm〜250/xm，分离范围为2X106〜25X106。最 常用者为Sepharose 4B。