蛇毒蛋白质分离实例

1. 磷脂酶A2 的分离纯化

从四种不同种类的蛇毒中分离出多种磷脂酶a2 (pla2)，其中一些已经结晶。与蛇毒的其他成分相比，PLA2的分离更为简单。在许多情况下，它首先通过SephadexG-50 或SephadexG-75 凝胶过滤，然后通过DEAE-Cellulose 或CM-Cellulose 柱以获得纯产品。这种酶虽然有多种纯化方法，但总得率不高，一般在20%30%。最近有两种纯化这种酶的新方法，一种是亲和层析，利用Rac-l-(9-carboxy)nonyl-2-hexadecylglycerol-3-phosphatidylcholine Alkali和HA-Sepharose4B通过羧基连接使亲和载体（称为PC-Sepharose4B）。

另一种方法是用异丙醇（50%）去除蛇毒中的大部分蛋白质沉淀，然后用氯化铷沉淀PLA2，沉淀的PLA2通过DEAE-Cellulose层析柱纯化。该方法操作简单，总收率高，与以往的方法相比具有很多优点。

1、亲和层析的所有操作均在5进行。柱子（0.9cmX15cm）装5mlPC-Sepharose4B，用10倍柱体积的BufferI洗涤，BufferI含有50mmol/LpH7.5Tris-HCl、25mmol/LCaCl2、0.2mol/LNaCl和1mmol/LEDTA，上样量为柱为10 mg 东部小菜蛾粗毒液，用2 ml Buffer I 溶解，样品加入色谱柱，2.5 ml 流下时停止，静置2 h。用5倍柱体积的BufferI洗涤，接着用5倍柱体积的BufferI洗涤，Buffer含有50mmol/LTris-HCl和50mmol/LEDTApH7.5。洗脱时流速为15ml/h，每管1.0ml对应每管A28。和PLA2活性测定，如图3-13-20所示。

这种方法得到的PLA2是两种异构体的混合物。如果要分离该组分中的两个PLA2，可以使用DEAE-Cellulose柱层析。这两种酶的产率为90%，凝胶电泳证明它们是纯的。

2、异丙醇沉淀取东部小菜蛾粗毒5g溶于0.05mol/L醋酸缓冲液250ml，缓冲液pH值为5.25，含10mmol/LCaCl 2 。向该溶液中加入250ml异丙醇，边加边搅拌，加入时间控制在30min。试验完成后450000Or/min离心30min，保留上方微浑浊溶液，弃去下方沉淀。向保留的混浊液中加入10ml0.5m0l/L NaCl（含0.05mol/L醋酸盐缓冲液），混匀，静置30min。同上离心，弃上清，用50 ml 0.05 mol/LTris-HCl 缓冲液（pH 8.0 含0.01 mol/LEDTA）溶解沉淀。缓冲液透析48 h，每18 h 更换一次缓冲液。将透析溶液离心并通过超滤浓缩至10ml。将浓缩后的酶液上DEAE-Cellulose柱，柱内凝胶用0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.01mol/LEDTA)预平衡。用指数曲线进行洗脱，使用带有三个容器的梯度仪，前两个容器各含400ml0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)，含1.0mmol/LEDTA0.02mol/LNaCl；每个容器含400ml 0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)，含1mmol/LEDTA0.2mol/LNaCl，洗脱时流速50ml/h，用泵保持恒压，每管收集5ml，并测量A28。值，如图3-13-21所示。

该方法可以分离东部小菜蛾响尾蛇毒液中的两种PLA2，这两种PLA2与亲和层析分离的PLA2具有相同的性质。

2. 伪箭毒神经毒素的分离

通常，此类毒素可以通过离子交换直接分离，有时与凝胶过滤结合使用效果更好。原则上各种阳离子交换树脂均可使用，但Bi0-Rex-70（又称AmberliteIRC-50）效果更好。下面介绍一些比较好的方法供参考。

选择凝结水颗粒小于400目的Bio-Rex-70。由于这种胶的交换容量高，使用时平衡时间比其他树脂长。由于羧基含量大，需要10倍柱体积的缓冲液才能通过柱后平衡，不同于以纤维素或Sephadex为载体的离子交换凝胶，需要的平衡液较少.实验中将Bio-Rex-70凝胶悬浮于5-10倍体积的0.2mol/L醋酸铵溶液中，用2mol/L氨水或醋酸滴定至pH6.5或pH7.3。倒掉上层溶液，重复上述过程23次，直至加入醋酸铵后pH值变化小于0.05单位。这种精确的平衡是未来更好实验结果的基础。使用醋酸铵作为洗脱液，凝胶本身是一种强缓冲液，pH值为6.5，流出液的pH值反映了凝胶处于平衡状态。当pH 值低于6.0 时，拟鼠毒素会不可逆地吸附到Bio-Rex-70 凝胶上。醋酸铵易挥发，冷冻干燥时易去除，还能提高毒素的溶解度。

卡尔森等人。 (1971)描述了从亚洲眼镜蛇毒液中提取拟箭毒神经毒素的过程，通过简单的Bio-Rex-70离子交换可以分离出纯品或接近纯品(杂质含量小于3%)。这种杂质可以通过Sephadex G-50 凝胶过滤去除。这种神经毒素也可以用磷酸纤维素、Se

三、激肽释放酶的纯化

许多蛇毒中的激肽释放酶都得到了纯化。纯化过程多用DEAE-Cellulose CM-Cellu- lose，或羟基磷石灰柱反复层析以除去激肽酶(破坏激肽的酶)和其他的精氨酸酯酶。大多 数蛇毒都含有二种激肽释放酶，这两种酶可以用Sephadex G-75或DEAE-Cellulose柱分 开，二者的区别不清楚，其中一种分子量可能较小。从日本蝮蛇蛇毒分离激肽释放酶的方法如下。

用pH7. 0,5. Ommol/L醋酸钠缓冲液溶解粗毒，浓度为100mg/ml，离心除去不溶物。 DEAE-Cellulose柱(3cmX 40cm)用同样的缓冲液平衡，蛇毒溶液上柱后用穹形洗脱梯度 进行洗脱，混合瓶为1L平衡液，贮存瓶为0. lmol/L醋酸钠缓冲液，pH为7. 0,洗脱一段 时间后换成0. 2mol/L pH7. 0的醋酸钠缓冲液，然后再换成0. 5mol/L PH7. 0的醋酸钠 缓冲液。洗脱时流速为25ml/h，每管9. 5ml，在4°C下收集，激肽释放酶在          第91〜          第120 管内。对激肽释放酶进行冷冻干燥浓缩至l0ml Sephadex G-75柱(2. 5cmX40cm)脱盐。

CM-Cellulose柱用5. 0mmol/L醋酸钠（pH6. 0)缓冲液平衡，脱盐后的酶液上柱 (1. 5cmX32. 5cm)用直线梯度进行洗脱，类凝血酶先被洗下来，接着下来的就是所需的组 分。该组分不含内肽酶、L-氨基酸氧化酶、PLA2、透明质酸酶、磷酸二酯酶和NAD核苷 酶。纯化的激肽释放酶的精氨酸酯水解活性占蛇毒总精氨酸酯水解活性的10%以上。用 这种方法最后洗下来的组分是具有促凝活性的物质，如图3-13-22所示。