中国蝮蛇毒抗凝组分的临床应用

蛇毒含有抗凝血成分，具有抗凝血活性。蛇毒抗凝成分的研究和应用始于20世纪60年代。 1963 年，当Reid 等人。在马来西亚观察一名被蛇蝎咬伤的病人，他们发现病人流血严重。经动物实验证实，蛇毒能使血液中的纤维蛋白原明显减少甚至消失，并具有抗凝血作用。 1968年，Bell报道了从马来西亚红口螺蛇毒中分离纯化的抗凝血剂Ancrod，用于治疗血栓形成获得抗凝作用。欧阳等。分别从Akikikiki Agkistrodon毒液和罗天头蛇毒液中纯化了抗凝血成分。 1980年，Sugihard等人还在台湾从五步蛇的毒液中纯化出两种抗凝因子和A。 20年代起，我国开始研究蛇毒的抗凝成分，并将其用于临床。 1978年，中国科学院昆明动物研究所首先在我国对尖吻蛇毒液进行研究，提取出蛇毒酶制剂——去纤酶，由福州医学院王青川、刘广芬教授研制，由福州医学院生产。福建省三明制药厂。通过生化和药理研究，发现它与蛇毒抗凝剂Ancrod有相似的作用。随后，辽宁省蛇毒研究协作组从蛇岛蕲蛇毒蛇毒液中提取酶制剂蛇刀君抗蛇检测酶（未获准生产）。 1981年，中国人民解放军第238医院与沉阳药学院合作，从东北陆生白蛇蛇种（蛇毒）中提取酶制剂清洗酶（又称复方蛇抗检酶）。 1984年，中国医科大学从浙江从毒蛇毒液中提取的酶制剂——江浙白蛇抗血栓酶经动物毒理学、药理实验和临床应用证明具有良好的抗凝血作用，取得了显着的效果用于治疗缺血性血管疾病和其他疾病。

多年的动物毒理学、药理实验和临床应用证明其具有良好的抗凝血作用，在治疗血栓性血管病方面取得了显着的疗效。 1985年，中国医科大学从江浙蝰蛇的毒液中提取出酶制剂——江浙白蛇抗血栓酶。但由于残留神经毒性量大，副作用明显，影响临床效果。虽然后来改为3号精品，但其实际有效成分仍明显低于溶栓酶。未来国内仿制药厂将近100家，产品质量参差不齐，各省质量标准也不一致。为此，卫生部药品监督管理局于1997年初制定了蛇毒样凝血酶品种的统一质量标准，以期统一标准，与国际接轨。规定名称为“去纤酶”，纯度必须为电泳纯（即一个电泳带）。这款新品无疑是一款优质的全新制剂。但从目前的生产技术来看，由于纯度要求的提高，生产成本大大增加，导致去纤酶的零售价比溶栓酶高出近100倍，但两者并无显着差异临床疗效好，价格低。 Fibrozyme对急性血栓形成有明显的疗效，但恢复期和后遗症效果不佳，绝大多数患者经济上负担不起。因此，从我国的实际情况出发，清血栓酶（Agkistrodon halys antithrombotic enzyme）应该是物美价廉的老产品，值得保留。

(-) 花蛇毒的成分和理化性质

0、大蛇毒的一般特征蛇毒成分复杂，含有酶类、非酶活性蛋白质、毒素、有机物和少量无机离子，具有多种生理和毒理作用。除尖吻蛇毒为无色液体外，常见的蛇毒为淡黄色半透明液体，呈弱酸性，比重1.03-1.06，常温下易失活，高温下形成絮状沉淀。冷冻干燥后成为结晶状颗粒或粉末，可长期保存。遇重金属离子、酚类、乙醇也能沉淀。易被氧化剂、还原剂、强酸、强碱等破坏，易被蛋白水解酶分解。

一、蕲蛇毒液中的酶近年来，由于采用先进的色谱分离方法，蕲蛇毒液中的许多成分得到了纯化。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，蕲蛇粗毒含有约20条蛋白染色条带。 1976年昆明动物研究所四室测定了白花蛇毒液中12种酶的活性，即：蛋白水解酶、精氨酸酯酶、L-氨基酸氧化酶、碱性磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、5'-核苷酸酶、ATP酶、核苷焦磷酸酶、核糖核酸酶、磷脂酶A2等。1976年，上海生理研究所第一研究室蛇毒组用DEAE-纤维素分离白蛇毒液，得到5个主要蛋白峰，研究了其中含有神经毒性成分。从该蛇毒中纯化得到的成分有：磷酸二酯酶、突触前神经毒素、碱性磷脂酶A2、酸性磷脂酶A2、凝血酶、激肽释放酶、缓激肽增强肽和突触后神经毒素等。1978年屠广丑等用DEAE-SephadexA-50分离浙江白花蛇毒，获得14个蛋白峰，测定各成分的酶活性。 1980年，陈建之等用DEAE-SephadexA-50柱层析法分离蛇岛蕲蛇毒液和长白山陆蕲蛇毒液。激肽释放酶活性和7 种其他酶的活性。后者包括蛋白水解酶、精氨酸酯酶、碱性磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、核糖核酸酶、L-氨基酸氧化酶、5'-核苷酸酶等； 12 个蛋白质峰和Agkistrodon halys 毒液中每个成分的活性。陈指出，射岛产蛇毒与浙江产蛇毒的柱色谱图和分离组分的生理活性分布不同。同年，滕国强等报道了用DEAE-Cellulose和DE22柱层析分离皖南山区五步蛇毒的结果。共获得15个蛋白峰，检测蛋白水解酶、精氨酸酯酶和磷脂酶A2的活性。决心。目前，已经获得了Agkistrodon毒液凝血酶和缓激肽释放酶的聚丙烯酰胺电泳纯样品，并测定了多种成分的氨基酸组成。一般而言，反蛇毒主要含有精氨酸酯酶、凝血酶样酶、激肽释放酶、纤溶酶、磷脂酶A2等，其特点是富含精氨酸酯酶，缺乏乙酰胆碱酯酶。

(1)精氨酸酯酶：是一种丝氨酸蛋白酶，底物特异性强，不作用于一般蛋白质底物，只作用于纤维蛋白原、激肽原等蛋白质分子中的特定肽键。类凝血酶、激肽释放酶和纤溶酶通常具有精氨酸酯酶活性。

凝血酶样。蕲蛇毒液中类凝血酶的精氨酸酯酶活性较高，与血液凝固系统密切相关。已从19 种Agkistrodae 蛇毒中分离出类凝血酶。 1981年，赵忠信、夏生强等人证实

定了这种酶在东北长 白山陆生白眉蝮蛇毒中的活性与制备方法，同年王淳等亦从尖吻蝮蛇毒中纯化出两种类 凝血酶,滕国强（1982)从皖南尖吻蝮蛇毒中纯化出该酶，管利丰等(1982)和孙菁等(1986) 分别检测出浙江短尾蝮蛇毒和江西产蝮蛇毒中的类凝血酶的活性。绝大多数类凝血酶系 糖蛋白，大多数酶的分子量都在30 000〜40 000之间。浙江短尾蝮类凝血酶分子量 43 000,由332个氨基酸组成。尖吻蝮类凝血酶分子量为33 500,由263个氨基酸组成。所 有已纯化的蛇毒类凝血酶均富含天门冬氨酸或门冬氨酰胺和谷氨酸。蛇毒类凝血酶一般 不引起血小板聚集，不激活凝血因子V、凝血因子W及凝血因子XI。从铜头蝮及浙江蝮蛇 毒分离得到的类凝血酶作用特点是:它们首先从纤维蛋白原中释放出血纤肽B(FPB)，再 缓慢释放血纤肽A(FPA),其凝血能力很弱，所形成的凝块远不如人凝血酶所形成的凝血 块结实。由于类凝血酶不能激活XI因子，能直接作用于纤维蛋白原使之凝集，所以它在 体外起凝血作用；但在体内，由于它作用生成的纤维蛋白质凝块没有侧链交联，易被血 流冲散并进一步被纤维蛋白溶酶降解，故在临床上表现为抗凝作用。尖吻蝮蛇毒去纤酶 能降解纤维蛋白原的《-链，作用和上述类凝血酶相类似。我国目前的蝮蛇毒酶制剂去纤 酶、清栓酶、江浙蝮蛇抗栓酶均系非纯化单一的类凝血酶，它们作为抗凝剂用于临床治 疗血栓病有疗效。

② 激肽释放酶:即舒缓激肽释放酶，又称激肽原酶或通透性因子，属于丝氨酸蛋白酶， 该酶在蝮亚科蛇毒中活力较高。已经从浙江蝮蛇毒中纯化出激肽释放酶I，分子量约为 30 000,稳定性较差，它的作用是使小动脉毛细血管扩张。

③ 纤溶酶:蝮亚科蛇毒中含该组分。分离出的浙江短尾蝮蛇毒第三个精氨酸酯酶活力 峰具有纤溶活性。

(2) 蛋白水解酶:属金属蛋白酶类，其底物较广，可水解酪蛋白和变性血红蛋白等。该 酶与蛇伤后组织出血和坏死有关。

(3) 磷脂酶A2:磷脂酶A2(PLA2)选择性地水解Sn-三磷酸甘油酯2位上的酯酰键。

有些PLA2能直接水解红细胞膜上的磷脂而使红细胞溶血。其中一些酶还具有突触前神 经毒素的活性，能选择性地阻断神经-肌肉传导中乙酰胆碱的释放(张景康等，1981)。我国 陈远聪等(1981，1984)从浙江蝮蛇毒中纯化了 3种磷脂酶八2，分子量约24 000,按等电点 不同分为中性、酸性和碱性磷脂酶A2。等电点6. 9的PLA2为突触前神经毒素;酸性磷脂 酶A2等电点为4. 5,是血小板聚集抑制剂;碱性磷脂酶A2等电点9. 3,具有极强的抗凝血 活性。鱗脂酶A2水解卵鱗脂后的产物花生四烯酸是体内合成血栓素A2(Thromboxane A2 TXA2)和前列腺素的原料，与血栓形成有密切关系。

蝮蛇毒还含有其他酶类，如L-氨基酸氧化酶、透明质酸酶和磷酸酯酶等，但含量较 低。

3. 蝮蛇毒素蝮蛇毒中的毒素主要为血循毒素，有些蛇毒还含有神经毒素。

(1) 血循毒素:血循毒素也有较强的致死毒性，其中出血毒素乃是血循毒蛇类引起致 死的主要因素。已经从皖南产尖吻蝮蛇毒中先后得到3个出血毒性组分，称为AaHI、 AaHI和AaHI，分子量均为2 2000,具致死毒性、蛋白水解酶活性和纤溶活性。前2种出 血毒素为酸性蛋白，后1种出血毒素为碱性蛋白。AaH I以出血作用为主，兼有肌溶作用； AaHI除有出血与肌溶作用外，对心肌有明显毒性;AaHI则以肌坏死作用为主。出血毒 素普遍具蛋白水解酶的活性。

(2) 神经毒素:我国浙江、江苏和江西产短尾蝮蛇毒含神经毒素，已分离的浙江蝮蛇毒 素是一种单链的中性磷脂酶A2，具突触前神经毒性。从新疆的蝮蛇中介亚种蛇毒中亦已 分离出神经毒素。长白山白盾蝮蛇毒中仅含血循毒素，未检测出神经毒素。

(3) 舒缓激肽增强肽:蛇毒中含有少量能增强舒缓激肽作用的小肽，由于它们能抑制 血管紧张素I转换成血管紧张素I，其作用主要是使毛细血管扩张，血压下降，刺激平滑 肌收缩，并能致痛。从浙江短尾蝮蛇毒中已分离出这种舒缓激肽增强肽。