蛇毒蛋白的分离技术 高压液相色谱技术

一、高压液相色谱的特点

高压液相色谱也称为高效液相色谱。它从经典的液相色谱中引入气相色谱理论，并对相体进行改造。配备高压输液泵、高灵敏度检测器、梯度洗脱装置、自动采集装置和电子计算机等，1960年代后期发展为现代液相色谱仪——型高压液相色谱仪。高压液相色谱法（HPLC）具有以下特点：

1、高压供液压力和注射压力很高，一般在I5.2MPa~35.45MPa以上。

2、色谱柱高速载液流速远高于经典液相色谱，可达1ml/min15ml/min。

3、效率高由于采用了新型固定相，提高了分离效率。

采用基于光学原理的高灵敏度检测器，如紫外吸收检测器、差示折光检测器、荧光检测器等，紫外吸收检测器的灵敏度可达10_9g/ml~KT^g/的数量级毫升。

梯度洗脱洗脱液的组成可以连续变化，增加了洗脱强度，缩短了分析时间。

二、高压液相色谱的分类

高压液相色谱按分离机理不同可分为4种：离子交换色谱、吸附色谱、空间排阻色谱（或凝胶渗透色谱）、分布色谱。

离子交换色谱是利用离子交换树脂上的可电离离子与流动相中带相同电荷的溶质离子进行可逆交换，这些离子由于在交换器上的亲和力不同而被分离。

M++Na+——CXS-树脂——M+——(XS—树脂+Na+

（解决方案）（解决方案）

x-+cr——按钮一resin——x——cho——resin+cr

（解决方案）

M+: 阳离子X，阴离子

常用作固定相的离子交换树脂有两种：多孔树脂和薄壳树脂。多孔树脂是球形纯离子交换树脂，薄壳树脂是在玻璃球上包覆一层薄薄的离子交换树脂。

凡是能在溶剂中解离的物质，通常都可用离子交换色谱法分离，离子交换色谱法广泛应用于氨基酸、药物、代谢物、无机盐和一般含离子化合物的分析。

流动相通常是含有少量水的有机混合溶剂。对于不同混合物的相似流动相，常采用梯度洗脱进行分离。

吸附色谱是根据吸附的不同来实现物质的分离。当样品分子与溶剂分子竞争吸附在固定相表面时，极性强、官能团多的样品分子具有较大的保留值。否则保持R'=ns/nm(1)

其中~为固定相中溶质的摩尔数，"m为流动相中溶质的摩尔数。在实际应用中，为了计算出

式中，from为某种溶质的保留时间，为未保留溶质在色谱柱中的保留时间。从这个公式可以看出，通过色谱柱时间长的化合物，其容量比较大。

(2)色谱柱的选择性

色谱柱选择性是指色谱柱对两种不同化合物产生不同保留时间的能力。色谱柱的选择性因子可根据下式计算，分别为化合物1和化合物2的保留时间。需要注意的是，在色谱分析过程中，一般会有两种以上的化合物存在。此时，可以使用彼此最接近的两种化合物来表示选择性。如果只对某些化合物感兴趣，也可以根据这些化合物确定色谱条件下的选择性。

(3)色谱柱的效率

所谓色谱柱的效率是指色谱柱在分析过程中阻止溶质分子扩散并获得较窄色谱峰的能力。柱效可以用理论塔板数来定量表示。

溶质洗脱峰对应的保留时间，W为溶质在基线处的洗脱峰宽。在相同的洗脱条件下，保留时间长的洗脱峰宽也增大。也就是说，当色谱柱采用相同的洗脱条件时，不同化合物的保留时间与洗脱峰宽的比值接近于一个常数，因此理论塔板数是色谱柱的一个特征参数， 理论塔板数大。色谱柱柱效高，理论塔板数多的色谱柱可以获得较窄的洗脱峰。然而，理论塔板数与色谱柱的长度密切相关，色谱柱越长，理论塔板数越高。为了便于不同色谱柱的比较，还需要一个与柱长无关的量，即理论塔板高H。

L 是柱长。 H可以用来衡量单位长度色谱柱的效率，H值越小，色谱柱的效率越高。由于色谱柱中区带的加宽是由纵向扩散、涡流扩散和传质等因素引起的，因此色谱柱的理论塔板高度也由这三个因素产生，即：

式中，H为载体粒径，Dm和AS为溶质分子在流动相和固定相中的扩散系数，D为固定相厚度，V为流速。

式中，第一项为涡流扩散产生，第二项为纵向扩散产生，第三、四项为传质产生。该公式表明柱效受多种因素影响。下面将进一步讨论该公式。

(4) 色谱分析的分辨率及其控制的一般原则

色谱柱的分离度无疑是任何色谱工作者最关心的问题，不断提高分离度是他们的主要目标。为了提高分离度，必须了解色谱分析中分离度与其他相关参数的关系。这种关系明确地表达在以下公式中：

这是分离度控制中的一个关键公式，说明色谱柱的分离度与色谱柱的柱效、色谱条件下溶质的容量比、色谱柱对溶质的选择性密切相关.下面根据公式逐项讨论提高色谱分析分辨率的一般原则。

1、分离度S与柱效7V 分离度公式（8）表明，色谱柱的分离度与柱效的平方根成正比，提高柱效是提高分离度最直接有效的手段.由于较长的色谱柱具有较大的理论塔板数iV，当需要提高分离度时，人们往往想到的方法之一就是增加柱长。将色谱柱长度加倍可将分辨率提高约40%。但是，如果柱长增加一倍，柱两端的压力也会增加一倍，溶质的稀释度也会更大。

从式(6)可以知道，色谱柱中载体颗粒直径的大小对色谱柱的效率有着极为重要的影 响，降低载体颗粒直径不仅影响到式(6)中的          第一项与          第四项，即涡流扩散及流动相质量 转移所产生的H，对于多孔载体来说，还会由于固定相厚度的减小而影响固定相质量转 移产生的H。因此使用直径较小的载体必将大大提高理论塔板数= ，从而得 到较高的分辨率。多年来人们的实践也证明，使用颗粒直径较小的载体是提高色谱柱分辨 率的一个十分有效的办法。使高效液相色谱与经典色谱法区别开来的一个重要的特点，正 是在于它使用了较经典色谱法小得多的载体。高效液相色谱法中，常用载体的直径为 10/nm和5/xm，更小的载体，即直径为3jnm的载体也许在不久的将来会在市场上出 现。

色谱柱选定以后，影响色谱效率的另一个重要因素就是流速。微粒多孔载体的色谱柱 有一个较好流速，在该流速时可以得到最小H值，亦即较大柱效率。这时，若流速增加，由 于溶质在固定相和流动相之间不能很好地平衡而使H值上升，柱效率下降;而流速下降 则会由于溶质的纵向扩散而降低柱效率。不过在一般情况下色谱分析中所使用的流速 (0.5ml/min〜2ml/min)总是大于该最适流速，因而可以通过降低流速而提高柱效率，无 需考虑较好流速。

提高柱效率的目的还可以通过增加溶质的扩散系数来实现。一种溶质在溶剂中的扩 散系数除了与溶质本身的分子大小和性质有关外，与溶剂的粘度也有着密切的关系。溶剂 的粘度越大，溶质的扩散系数就越小，用粘度大的溶剂做流动相时柱效率随之而降低，因 此在色谱中总是尽可能选择粘度较小的溶剂，有时还在较高的温度下进行色谱分析，以降 低流动相的粘度,提高柱效率。

2.分辨率沁与溶量比，分辨率与成正比，因此当，为0时，亦 即溶质在固定相中的克分子数为0时分辨率为0,这意味着不能进入静止相的溶质在色 谱柱中得不到分离。尺'增加后分辨率也随之增加。在高效液相色谱中一般将^控制在2 〜5之间。当R'超过5时，R'的增加将使色谱间大大延长而分辨率提高有限，这一现象

 从表3-13-7可以清楚地看到。一种溶质在高效液相色谱中的 容量比受到流动相溶剂的强度的控制。所谓溶剂的强度指的是溶剂在色谱柱中洗脱溶质的能力的大小。凡洗脱能力强的溶剂就是强溶剂，洗脱能力弱的是弱溶剂。无论是强溶剂还是弱溶剂的性质都不是一成 不变的。性质不同的载体对强溶剂

的物理化学性质的要求也不同。例如正常相色谱法中亲水性强的溶剂为强溶剂，在反相色 谱中疏水性强的溶剂为强溶剂，而在离子交换色谱中以离子强度大的溶剂为强溶剂。

在整个色谱过程中如果只用一种溶剂洗脱，在洗脱过程中溶剂的强度不变，这种洗脱 方式通常称为等强度洗脱。这种洗脱方式的较大优点是操作简单。但在分析比较复杂的 样品时如只用一种溶剂不能得到满意的分离效果，就应考虑用梯度洗脱。所谓梯度洗脱就 是在洗脱过程中分步地或者连续地改变流动相的组成，使其溶剂强度由弱到强逐渐增加。 分步地或连续地改变流动相的洗脱过程分别称为分步梯度洗脱，或连续梯度洗脱。至于用 什么样的梯度洗脱最为合适，只有通过试验才能知道。

3.分辨率与选择性因子《增加选择性因子《显然可以增加色谱分析的分辨率。 然而问题在于〃的变化不像柱效率W以及容量比^那样有规律可循。不同因素对《影 响难以预测，特别是在样品中含有多种化合物时，其中一部分化合物的选择性因子增加往 往伴随着另一些化合物选择性因子下降。因此常常需要经过多次试验才能得到较为满意 的选择性。这里只能列出几个可能影响选择性因子的主要因素，供色谱实验时考虑。

改变流动相的溶剂:在希望增加色谱的选择性因子时，首先考虑的途径是用不同 类型的溶剂作为流动相。由于不同的溶剂与溶质间相互作用的特点不一样，它们能使溶质 的色谱行为发生变化，因而有可能通过选择不同类型的溶剂改进选择性特性。

改变流动相的pH值:这一手段只适用于可电离化合物的色谱分析。不同的化合 物以及不同化合物产生的影响也不一样。由于一种化合物带电荷的多少能影响其溶解特 性，或是它与固定相结合的强度，从而进一步改变它在色谱柱中的滞留行为，因此pH的 变化对可电离化合物色谱分析的选择性影响是较大的。

改变固定相:不同的固定相与被分离化合物之间的相互作用的性质、特点以及强 弱各不相同。例如吸附色谱法分离几何异构体的效果较好，反相色谱法主要根据化合物 疏水基团的特性进行分离，离子交换色谱法恰恰相反，适于分离带有不同的电荷的化合 物。因此应当根据要分离化合物的特点来选择合适的固定相。