黄志坚1，陈勇贵1，翁少萍1，2，路晓锋1，钟立洪1，范文洲2，陈旭凌1，张慧文2，何建国1，2
俗话说，磨刀不误砍柴工，只有我们认真的学习了对虾养殖的知识，才能够在后期养殖对虾过程中解决我们遇到的各种突发状况，有效的提高对虾养殖产量。
(1．水产品安全教育部重点实验室∥中山大学海洋学院，广东广州 510275；2．中山大学生命科学学院，广东广州 510275)
摘要：近年来，在中国南方超过50%以上的凡纳滨对虾养殖场在养殖30d后爆发1种疾病，导致80%以上的养殖对虾死亡。患病对虾临床症状为肝胰腺萎缩坏死、活动力减弱、对虾在池塘底部死亡，发病初期水面和池塘边观察不到病虾，因此养殖者通常将该病称为“偷死病”。患病对虾肝胰腺萎缩坏死是主要症状，因此，我们称这种对虾疾病为对虾肝胰腺坏死症(HPNS)。2012年3月－2013年10月，我们在中国南方广东、海南和广西3个省的12个养殖地区采集具有HPNS症状的凡纳滨对虾进行了组织病理观察、病毒检测与人工感染、细菌分离鉴定与人工感染研究。组织病理学研究表明具有HPNS症状的病虾肝胰腺坏死，在部分区域肝胰腺管细胞消失，肝胰腺小管间结缔组织减少。对305尾HPNS对虾进行11种对虾病毒PCＲ检测，并采用人工病毒感染方式感染健康对虾，感染对虾不表现HPNS症状。从63尾HPNS病虾的肝胰腺、血淋巴和肠道分离鉴定383株细菌，这些细菌分别属于10个属，49种细菌，每尾对虾均混合感染多种细菌，其中38尾对虾中分离到副溶血弧菌，34尾对虾中分离到蜡样芽孢杆菌，20尾对虾中分离到苏云金芽孢杆菌，19尾对虾中分离到霍乱弧菌。选取副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌分别采用注射和浸泡方式感染健康对虾，感染对虾均出现HPNS症状。结果表明多种细菌与凡纳滨对虾HPNS爆发有关。
关键词：凡纳滨对虾；肝胰腺坏死症；细菌；病毒
凡纳滨对虾现为世界第一大养殖对虾种，占世界养殖对虾总产量的70%。中国凡纳滨对虾养殖产量占全球对虾养殖产量的30%，2012年中国养殖凡纳滨对虾养殖产量达到145.32万t。近年来，一种称为早期死亡综合症(EMS)或急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)的对虾疾病在中国、泰国、越南、印度尼西亚、印度和墨西哥等地对虾养殖场中爆发。EMS/AHPNS导致全球对虾养殖产业严重损失。最近在中国南方超过50%以上的凡纳滨对虾养殖场在养殖30d后爆发1种疾病，导致80%以上的养殖对虾死亡。患病对虾临床症状为肝胰腺萎缩坏死、活动力减弱、在池塘底部死亡，水面和池塘边观察不到病虾，因此对虾养殖者通常将该病称为“偷死病”。肝胰腺萎缩坏死是患病对虾的主要临床症状，因此，我们称这种对虾疾病为对虾肝胰腺坏死症(HPNS)。尽管患有HPNS的对虾与患有EMS/AHPNS的对虾均表现为肝胰腺坏死，但HPNS对虾与EMS/AHPNS对虾不同，EMS/AHPNS是在对虾养殖早期死亡(一般在7～30d的养殖时间发病)，发病速度快，有报道认为EMS/AHPNS是由1株高致病力的副溶血弧菌致病菌引起对虾急性大量死亡。与EMS/AHPNS相比，HPNS的爆发和发病进程相对比较缓慢，而且HPNS一般发生在凡纳滨对虾养殖30d以后，池塘养殖对虾不会在短时间内大量死亡，而是逐渐死亡，养殖到90d左右，死亡率达到80%。
为了研究对虾HPNS爆发是否跟细菌和/或病毒等因素有关，本文开展了组织病理学、病毒检测与人工感染、细菌分离鉴定与人工感染等方面的研究。
1 材料和方法
1.1 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾样品采集
于2012年3月－2013年10月分别在中国南方广东、海南和广西3个省的12个凡纳滨对虾主要养殖区域收集具有典型HPNS症状的病虾肝胰腺、血淋巴和肠道样品。为了检测细菌或病毒病原，病虾样品分别在现场进行不同处理和保存。采用无菌操作方法现场取患病凡纳滨对虾的肝胰腺、血液、肠道，用接种环分别在LB、TSA、TCBS、BHI平板培养基上划线接种，平板培养基密封保存带回实验室用于检测和鉴定细菌。现场采集的病虾样品用冰盒冷冻，封装后带回实验室，存放于-80℃冻存用于对虾DNA病毒检测和病毒人工感染。同时取对虾不同组织用RNA later液(USA)于-80℃保存，用于对虾RNA病毒检测。采集患病对虾样品同时用Davidson'sAFA组织固定液固定用于组织病理分析。
1.2 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾组织病理观察
采集36尾HPNS对虾肝胰腺，Davidson'sAFA组织固定液固定，固定12～24h后换φ=70%酒精保存。将固定的对虾组织用无菌去离子水冲洗12h，然后用φ为50%、70%、80%、90%、95%、100%的梯度酒精逐级脱水，二甲苯透明、透蜡，石蜡包埋、切片，苏木精－伊红(H＆E)染色，光学显微镜下观察并拍照。
1.3 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾病毒PCR检测
采用酚氯仿法提取HPNS对虾基因组DNA进行对虾DNA病毒检测。采用Trizol法(USA)提取HPNS对虾总RNA，并用Primescript1st Strand cDNA SynthesisKit(TaKaRa，Japan)试剂盒进行逆转录以检测HPNS对虾RNA病毒。针对各种对虾病毒性病原的高度保守区段设计特异性引物，采用PCR检测方法分别检测白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BPV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、黄头病毒(YHV)、桃拉综合症病毒(TSV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、莫里恩病毒(MOV)、罗氏沼虾诺达病毒卫星病毒(XSV)和生长缓慢综合症病毒(LSNV)。对虾病毒检测所用引物均由Invitrogen公司合成，引物信息见表1。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸10min。PCR扩增产物经w=1%琼脂糖凝胶电泳检测后分析。
1.4 病毒人工感染
实验所用健康凡纳滨对虾(均质量5g)由中山大学海洋生物技术研究开发中心珠海基地提供。选取容积为0.8m3的水族箱，试验用水为天然海水，水温28～32℃。选取大小均一适中、活力较好的对虾放入水族箱暂养3～5d，24h充气，每天按时喂料并吸污换水，直至对虾生长状况稳定。感染试验分组前，随机选取10尾试验对虾进行对虾病毒检测，没有检测到病毒的对虾可进行病毒攻毒试验。
小心剥离30尾具典型HPNS症状的病虾头胸甲，称取病虾头胸部用10倍体积的无菌PBS用匀浆器在冰上匀浆，匀浆液在5000r/min离心10min，上清经0.45μm滤膜过滤，10倍体积PBS液稀释用于对虾感染。实验健康对虾分为过滤组、未过滤组和对照组3个组，每个组设3个平行组，每个平行组30尾对虾。过滤组和未过滤组分别用0.5mL过滤液和未过滤液稀释液注射感染健康对虾，对照组注射等量无菌PBS缓冲液，观察7d。感染7d后，每个平行组随机选取5尾对虾进行病毒检测。
1.5 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾细菌分离和鉴定
从HPNS病虾肝胰腺、血淋巴和肠道分离的细菌在LB，TSA，TCBS和BHI不同培养基上28℃培养24h，挑取优势单一菌落在培养基中再次划线纯化和培养，直至获得纯化的单一菌落。采用传统微生物学鉴定方法进行细菌鉴定。细菌16S rDNA基因扩增采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，Beijing)提取细菌基因组DNA。16SDNA扩增反应的引物为通用引物，正向引物序列：5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，反向引物序列：5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'，由上海英骏生物科技有限公司合成。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸5min。PCR扩增产物经w=1%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海英骏公司测序，测序结果用BLAST软件进行同源性比对，ClustalX软件进行多序列比对，MEGA4.0软件进行系统进化树的构建，以进行细菌种类鉴定和分析。
1.6 副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌人工感染凡纳滨对虾
选取来源于HPNS对虾肝胰腺的副溶血弧菌(VP)和来源于HPNS对虾肠道的苏云金芽孢杆菌(BT)，分别采取肌肉注射感染及浸泡感染方式进行凡纳滨对虾肝胰腺坏死症细菌人工感染。
注射感染对虾分为4个组，每个组设3个平行组，每个平行组30尾对虾，分别注射细菌浓度为106cfu.mL－1的VP、BT和VP+BT菌液50μL/尾，对照组对虾注射等量无菌PBS，注射剂量均为50μL/尾。浸泡感染也分为4个组，每个组设3个平行组，每个平行组30尾对虾，感染对虾分别用细菌终浓度为105cfu.mL－1的VP、BT和VP+BT菌液浸泡，对照组用天然海水浸泡。不同方式感染对虾观察14d，记录对虾感染症状和死亡情况，从感染对虾中分离和鉴定细菌，同时取感染对虾组织用AFA组织固定液固定，用常规组织学方法进行组织病理学检测。
2 结果
2.1 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾症状和组织病理观察
患HPNS对虾的主要症状是活力减弱，摄食减弱或不摄食，肝胰腺边缘不清晰呈弥散状，最后肝胰腺萎缩坏事(图1－a，图1－a')。与健康凡纳滨对虾(图1－b，图1－b'，图1－c)比较，患病对虾肝胰腺肝小管B，F，R细胞坏死或脱落，肝小管间结缔组织松散或坏死，严重者肝小管崩解(图1－d)。
图1 HPNS对虾症状和组织病理观察
a：具HPNS症状的病虾，箭头指示病虾的肝胰腺；a'：具HPNS症状病虾的肝胰腺，箭头指示病虾的肝胰腺；b：健康对虾症状，箭头指示健康对虾的肝胰腺；b'：健康对虾的肝胰腺，箭头指示健康对虾的肝胰腺；c：健康对虾肝胰腺组织病理观察；d：病虾肝胰腺组织病理观察，箭头指示肝小管间结缔组织受到破坏
2.2 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾病毒检测和人工感染
采用PCR方法针对305尾具有HPNS症状的患病对虾进行对虾病毒检测携带情况。检测结果显示，可检测到WSSV、IHHNV2种病毒，BPV、MBV、HPV、YHV、TSV、IMNV、MOV、XSV、LSNV等其余9种病毒在所有样品中均未检测出。其中WSSV一扩中未检出，仅在二扩中检出，二扩
检出率为66.7%，IHHNV仅检出2例。
选取具典型HPNS症状的病虾头胸部组织制备组织匀浆液，分别用不经微孔滤膜过滤的组织匀浆液和经微孔滤膜过滤的组织匀浆液注射感染健康对虾，感染后7d统计结果，未过滤组对虾死亡率达到100%，表现典型肝胰腺坏死症状，过滤组对虾在实验期内没有死亡。对照组对虾在实验期内也没有死亡。感染结果表明病毒不是HPNS的主要病因。
2.3 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾细菌分离鉴定
从63尾具HPNS症状的对虾不同组织中分离鉴定49种细菌，分别属于10个属。所有这些细菌中，肝胰腺分离鉴定34种细菌，肠道31种，血淋巴39种(表2)。
其中弧菌属Vibrio10种，包括副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈维氏弧菌V．harveyi、溶藻弧菌V．alginolyticus、霍乱弧菌V．cholera、河流弧菌V．fluvialis、创伤弧菌V．vulnificus、弗尼斯弧菌V．furnissii、远青弧菌V．azureus、需钠弧菌V．natriegens、拟态弧菌V．mimicus；芽孢杆菌属Bacillus11种，包括蜡样芽孢杆菌B．cereus、解淀粉芽孢杆菌B．amyloliquefaciens、地衣芽孢杆菌B．licheniformis、苏云金芽孢杆菌B．thuringiensis、枯草芽孢杆菌B．subtilis、高地芽孢杆菌B．altitudinis、死谷芽孢杆菌B．vallismortis、巨大芽孢杆菌B．megaterium、弯曲芽孢杆菌B．flexus、韩国芽孢杆菌B．koreensis、南海恩施芽孢杆菌B．ensch；气单胞菌属Aeromonas7种，包括豚鼠气单胞菌A．caviae、嗜水气单胞菌A．hydrophila、维罗纳气单胞菌A．veronii、温和气单胞菌A．sobria、斑点气单胞菌A．punctata、舒氏气单胞菌A．schubertii、肠棕气单胞菌A．enteropelogenes；微小杆菌属Exiguobacterium5种，包括印度微小杆菌E．indicum、金橙黄微小杆菌E．aurantiacum、乙酰微小杆菌E．acetylicum、深海微小杆菌E．profundum、海洋微球菌E．marinum；葡萄球菌属Staphylococcus6种，包括沃氏葡萄球菌S．warneri、木糖葡萄球菌S．xylosus、巴氏葡萄球菌S．pasteuri、路邓葡萄球菌S．lugdunensis、松鼠葡萄球菌S．sciuri、腐生葡萄球菌S．saprophyticus；不动杆菌属Acinetobacter3种，包括约氏不动杆菌A．johnsonii、泛耐药鲍曼不动杆菌A．baumnnii、溶血不动杆菌A．heamolyticus；希瓦氏菌属Shewanella3种，包括脱色希瓦氏菌S．decolorationis、海藻希瓦氏菌S．algae、鲍希瓦氏菌S．haliotis；发光杆菌属Photobacterium2种，包括美人鱼发光杆菌P．damselae和鳆发光杆菌P．leiognathi；肠杆菌属Enterobacter1种，阿氏肠杆菌Enterobacterasburiae；假单胞菌属Pseudomonas1种，包括弯曲假单胞菌P．geniculate。
在63尾患病对虾中，38尾对虾中鉴定有副溶血弧菌V．parahaemolyticus，其余25尾没有分离到，占鉴定对虾总数的60.3%；有蜡样芽孢杆菌B.cereus的对虾34尾，其余29尾没有分离到，占鉴定对虾总数的54.0%；有苏云金芽孢杆菌B．thuringiensis的对虾20尾，其余43尾没有分离到，占鉴定对虾总数的31.8%；有霍乱弧菌V．cholera的对虾19尾，其余44尾没有分离到，占鉴定对虾总数的30.2%；有金橙黄微小杆菌E．aurantiacum的对虾14尾，占鉴定对虾总数的22.2%；有嗜水气单胞菌A．hydrophila的对虾11尾，占鉴定对虾总数的17.5%；解淀粉芽孢杆菌B．amyloliquefaciens的对虾为7尾，分别占鉴定对虾总数的11.1%；其他种细菌分别从一些HPNS单尾虾中分离鉴定(表2)。不同种类细菌可以从不同的单尾HPNS病虾中分离，单尾HPNS病虾中最多鉴定细菌9种，最少鉴定细菌3种。以上结果表明多种细菌可能与对虾HPNS爆发有关。
表2 63尾HPNS对虾肝胰腺、肠道和血淋巴中分离鉴定的细菌
2.4 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾细菌人工感染
用副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌分别注射感染健康对虾，在感染后6d全部死亡，死亡率100%，表现典型肝胰腺坏死症状。对照组死亡率为12%，没有肝胰腺坏死症状(图2)。用副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌分别浸泡感染健康对虾，感染组对虾缓慢死亡，在感染后14d统计结果，VP+BT混合菌感染组对虾死亡率较高，达到75%，VP感染组对虾死亡率达到66%，BT感染组对虾死亡率为62%，感染组死亡对虾表现典型肝胰腺坏死症状。对照组死亡率为16%，没有肝胰腺坏死症状(图3)。
图2 副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌注射感染对虾的情况
图3 副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌浸泡感染对虾的情况
取不同感染方式感染对虾进行病毒PCR检测，未检查到病毒。感染对虾重新进行细菌分离和鉴定，V1感染组对虾中分离鉴定出副溶血弧菌，Z7感染组对虾中分离鉴定出苏云金芽孢杆菌，V1+Z7混合感染组分离鉴定的细菌有副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌，两种细菌都可以分别从人工感染对虾中对应重新分离。这些结果表明副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌都可以感染健康对虾产生HPNS症状。
分别用副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT以及两者的混合菌液VP+BT注射感染和浸泡感染健康对虾，病虾均能产生与对虾自然发病的HPNS症状：摄食减少或不摄食，肝胰腺萎缩，B、F、Ｒ细胞坏死(图4)。
图4 副溶血弧菌VP和苏云金芽孢杆菌BT感染对虾组织病理观察
a：苏云金芽孢杆菌BT浸泡感染对虾的肝胰腺组织切片观察；b：副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌混合菌浸泡感染对虾的肝胰腺组织切片观察；c：副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌混合菌注射感染对虾的肝胰腺组织切片观察
3 讨论
有报道采用PCR方法证明WSSV、YHV、IMNV和TSV等对虾病毒不是EMS的病因。在本研究中我们运用PCR方法检测HPNS病虾11种对虾病毒，只有WSSV和IHHNV2种病毒可检测出，但病毒人工感染对虾并没有产生HPNS。因此对虾HPNS不是由单一病毒引起的。
为了确定HPNS产生是否与细菌有关，我们采集63尾HPNS病虾进行细菌分离鉴定，细菌可以从每一尾对虾的肝胰腺、血淋巴和肠道分离，经鉴定，这些细菌属于10个属，没有单一的一种细菌可以从所有63尾HPNS病虾中分离。比如，副溶血弧菌只从其中的38尾对虾中分离到，蜡样芽孢杆菌从其中34尾对虾中分离到，苏云金芽孢杆菌从其中20尾对虾分离到，霍乱弧菌从其中19尾对虾分离到。我们选择副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌人工感染健康对虾，所有发病对虾均表现HPNS症状。结果表明HPNS产生与多种细菌种类有关。
为什么HPNS产生会与多种细菌有关呢?我们认为这要归结于水体理化因子和有毒藻类的胁迫。HPNS爆发与水体理化因子(如氨氮，亚硝酸盐等)密切相关。在氨和亚硝酸盐浓度较高的养殖池塘越容易爆发HPNS感染。如果爆发HPNS疾病，减料停料可以有效降低养殖水体氨氮浓度并有效控制疾病的产展(未发表数据)。如果养殖池塘有毒藻类爆发，HPNS也会产生(未发表数据)。在对虾养殖中，减料和/或减少养殖密度将降低HPNS爆发的风险，而且对虾和不同鱼类(罗非鱼、草鱼、胡子鲶等)混养可以有效改善养殖环境并且降低HPNS爆发的风险(未发表数据)。因此，我们认为对虾养殖生态系统平衡被打破是HPNS爆发的根本原因，养殖生态系统紊乱，导致条件致病菌大量产生和氨氮胁迫，对虾处于亚健康状态，多种细菌包括在非胁迫条件下不能感染对虾的细菌也可以感染对虾。环境胁迫及导致条件致病菌繁生的生态系统是对虾发生HPNS的根本原因。
俗话说，磨刀不误砍柴工，只有我们认真的学习了对虾养殖的知识，才能够在后期养殖对虾过程中解决我们遇到的各种突发状况，有效的提高对虾养殖产量。
(1．水产品安全教育部重点实验室∥中山大学海洋学院，广东广州 510275；2．中山大学生命科学学院，广东广州 510275)
摘要：近年来，在中国南方超过50%以上的凡纳滨对虾养殖场在养殖30d后爆发1种疾病，导致80%以上的养殖对虾死亡。患病对虾临床症状为肝胰腺萎缩坏死、活动力减弱、对虾在池塘底部死亡，发病初期水面和池塘边观察不到病虾，因此养殖者通常将该病称为“偷死病”。患病对虾肝胰腺萎缩坏死是主要症状，因此，我们称这种对虾疾病为对虾肝胰腺坏死症(HPNS)。2012年3月－2013年10月，我们在中国南方广东、海南和广西3个省的12个养殖地区采集具有HPNS症状的凡纳滨对虾进行了组织病理观察、病毒检测与人工感染、细菌分离鉴定与人工感染研究。组织病理学研究表明具有HPNS症状的病虾肝胰腺坏死，在部分区域肝胰腺管细胞消失，肝胰腺小管间结缔组织减少。对305尾HPNS对虾进行11种对虾病毒PCＲ检测，并采用人工病毒感染方式感染健康对虾，感染对虾不表现HPNS症状。从63尾HPNS病虾的肝胰腺、血淋巴和肠道分离鉴定383株细菌，这些细菌分别属于10个属，49种细菌，每尾对虾均混合感染多种细菌，其中38尾对虾中分离到副溶血弧菌，34尾对虾中分离到蜡样芽孢杆菌，20尾对虾中分离到苏云金芽孢杆菌，19尾对虾中分离到霍乱弧菌。选取副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌分别采用注射和浸泡方式感染健康对虾，感染对虾均出现HPNS症状。结果表明多种细菌与凡纳滨对虾HPNS爆发有关。
关键词：凡纳滨对虾；肝胰腺坏死症；细菌；病毒
凡纳滨对虾现为世界第一大养殖对虾种，占世界养殖对虾总产量的70%。中国凡纳滨对虾养殖产量占全球对虾养殖产量的30%，2012年中国养殖凡纳滨对虾养殖产量达到145.32万t。近年来，一种称为早期死亡综合症(EMS)或急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)的对虾疾病在中国、泰国、越南、印度尼西亚、印度和墨西哥等地对虾养殖场中爆发。EMS/AHPNS导致全球对虾养殖产业严重损失。最近在中国南方超过50%以上的凡纳滨对虾养殖场在养殖30d后爆发1种疾病，导致80%以上的养殖对虾死亡。患病对虾临床症状为肝胰腺萎缩坏死、活动力减弱、在池塘底部死亡，水面和池塘边观察不到病虾，因此对虾养殖者通常将该病称为“偷死病”。肝胰腺萎缩坏死是患病对虾的主要临床症状，因此，我们称这种对虾疾病为对虾肝胰腺坏死症(HPNS)。尽管患有HPNS的对虾与患有EMS/AHPNS的对虾均表现为肝胰腺坏死，但HPNS对虾与EMS/AHPNS对虾不同，EMS/AHPNS是在对虾养殖早期死亡(一般在7～30d的养殖时间发病)，发病速度快，有报道认为EMS/AHPNS是由1株高致病力的副溶血弧菌致病菌引起对虾急性大量死亡。与EMS/AHPNS相比，HPNS的爆发和发病进程相对比较缓慢，而且HPNS一般发生在凡纳滨对虾养殖30d以后，池塘养殖对虾不会在短时间内大量死亡，而是逐渐死亡，养殖到90d左右，死亡率达到80%。
为了研究对虾HPNS爆发是否跟细菌和/或病毒等因素有关，本文开展了组织病理学、病毒检测与人工感染、细菌分离鉴定与人工感染等方面的研究。
1 材料和方法
1.1 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾样品采集
于2012年3月－2013年10月分别在中国南方广东、海南和广西3个省的12个凡纳滨对虾主要养殖区域收集具有典型HPNS症状的病虾肝胰腺、血淋巴和肠道样品。为了检测细菌或病毒病原，病虾样品分别在现场进行不同处理和保存。采用无菌操作方法现场取患病凡纳滨对虾的肝胰腺、血液、肠道，用接种环分别在LB、TSA、TCBS、BHI平板培养基上划线接种，平板培养基密封保存带回实验室用于检测和鉴定细菌。现场采集的病虾样品用冰盒冷冻，封装后带回实验室，存放于-80℃冻存用于对虾DNA病毒检测和病毒人工感染。同时取对虾不同组织用RNA later液(USA)于-80℃保存，用于对虾RNA病毒检测。采集患病对虾样品同时用Davidson'sAFA组织固定液固定用于组织病理分析。
1.2 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾组织病理观察
采集36尾HPNS对虾肝胰腺，Davidson'sAFA组织固定液固定，固定12～24h后换φ=70%酒精保存。将固定的对虾组织用无菌去离子水冲洗12h，然后用φ为50%、70%、80%、90%、95%、100%的梯度酒精逐级脱水，二甲苯透明、透蜡，石蜡包埋、切片，苏木精－伊红(H＆E)染色，光学显微镜下观察并拍照。
1.3 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾病毒PCR检测
采用酚氯仿法提取HPNS对虾基因组DNA进行对虾DNA病毒检测。采用Trizol法(USA)提取HPNS对虾总RNA，并用Primescript1st Strand cDNA SynthesisKit(TaKaRa，Japan)试剂盒进行逆转录以检测HPNS对虾RNA病毒。针对各种对虾病毒性病原的高度保守区段设计特异性引物，采用PCR检测方法分别检测白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BPV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、黄头病毒(YHV)、桃拉综合症病毒(TSV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、莫里恩病毒(MOV)、罗氏沼虾诺达病毒卫星病毒(XSV)和生长缓慢综合症病毒(LSNV)。对虾病毒检测所用引物均由Invitrogen公司合成，引物信息见表1。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸10min。PCR扩增产物经w=1%琼脂糖凝胶电泳检测后分析。
1.4 病毒人工感染
实验所用健康凡纳滨对虾(均质量5g)由中山大学海洋生物技术研究开发中心珠海基地提供。选取容积为0.8m3的水族箱，试验用水为天然海水，水温28～32℃。选取大小均一适中、活力较好的对虾放入水族箱暂养3～5d，24h充气，每天按时喂料并吸污换水，直至对虾生长状况稳定。感染试验分组前，随机选取10尾试验对虾进行对虾病毒检测，没有检测到病毒的对虾可进行病毒攻毒试验。
小心剥离30尾具典型HPNS症状的病虾头胸甲，称取病虾头胸部用10倍体积的无菌PBS用匀浆器在冰上匀浆，匀浆液在5000r/min离心10min，上清经0.45μm滤膜过滤，10倍体积PBS液稀释用于对虾感染。实验健康对虾分为过滤组、未过滤组和对照组3个组，每个组设3个平行组，每个平行组30尾对虾。过滤组和未过滤组分别用0.5mL过滤液和未过滤液稀释液注射感染健康对虾，对照组注射等量无菌PBS缓冲液，观察7d。感染7d后，每个平行组随机选取5尾对虾进行病毒检测。
1.5 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾细菌分离和鉴定
从HPNS病虾肝胰腺、血淋巴和肠道分离的细菌在LB，TSA，TCBS和BHI不同培养基上28℃培养24h，挑取优势单一菌落在培养基中再次划线纯化和培养，直至获得纯化的单一菌落。采用传统微生物学鉴定方法进行细菌鉴定。细菌16S rDNA基因扩增采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，Beijing)提取细菌基因组DNA。16SDNA扩增反应的引物为通用引物，正向引物序列：5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，反向引物序列：5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'，由上海英骏生物科技有限公司合成。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸5min。PCR扩增产物经w=1%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海英骏公司测序，测序结果用BLAST软件进行同源性比对，ClustalX软件进行多序列比对，MEGA4.0软件进行系统进化树的构建，以进行细菌种类鉴定和分析。
1.6 副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌人工感染凡纳滨对虾
选取来源于HPNS对虾肝胰腺的副溶血弧菌(VP)和来源于HPNS对虾肠道的苏云金芽孢杆菌(BT)，分别采取肌肉注射感染及浸泡感染方式进行凡纳滨对虾肝胰腺坏死症细菌人工感染。
注射感染对虾分为4个组，每个组设3个平行组，每个平行组30尾对虾，分别注射细菌浓度为106cfu.mL－1的VP、BT和VP+BT菌液50μL/尾，对照组对虾注射等量无菌PBS，注射剂量均为50μL/尾。浸泡感染也分为4个组，每个组设3个平行组，每个平行组30尾对虾，感染对虾分别用细菌终浓度为105cfu.mL－1的VP、BT和VP+BT菌液浸泡，对照组用天然海水浸泡。不同方式感染对虾观察14d，记录对虾感染症状和死亡情况，从感染对虾中分离和鉴定细菌，同时取感染对虾组织用AFA组织固定液固定，用常规组织学方法进行组织病理学检测。
2 结果
2.1 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾症状和组织病理观察
患HPNS对虾的主要症状是活力减弱，摄食减弱或不摄食，肝胰腺边缘不清晰呈弥散状，最后肝胰腺萎缩坏事(图1－a，图1－a')。与健康凡纳滨对虾(图1－b，图1－b'，图1－c)比较，患病对虾肝胰腺肝小管B，F，R细胞坏死或脱落，肝小管间结缔组织松散或坏死，严重者肝小管崩解(图1－d)。
图1 HPNS对虾症状和组织病理观察
a：具HPNS症状的病虾，箭头指示病虾的肝胰腺；a'：具HPNS症状病虾的肝胰腺，箭头指示病虾的肝胰腺；b：健康对虾症状，箭头指示健康对虾的肝胰腺；b'：健康对虾的肝胰腺，箭头指示健康对虾的肝胰腺；c：健康对虾肝胰腺组织病理观察；d：病虾肝胰腺组织病理观察，箭头指示肝小管间结缔组织受到破坏
2.2 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾病毒检测和人工感染
采用PCR方法针对305尾具有HPNS症状的患病对虾进行对虾病毒检测携带情况。检测结果显示，可检测到WSSV、IHHNV2种病毒，BPV、MBV、HPV、YHV、TSV、IMNV、MOV、XSV、LSNV等其余9种病毒在所有样品中均未检测出。其中WSSV一扩中未检出，仅在二扩中检出，二扩
检出率为66.7%，IHHNV仅检出2例。
选取具典型HPNS症状的病虾头胸部组织制备组织匀浆液，分别用不经微孔滤膜过滤的组织匀浆液和经微孔滤膜过滤的组织匀浆液注射感染健康对虾，感染后7d统计结果，未过滤组对虾死亡率达到100%，表现典型肝胰腺坏死症状，过滤组对虾在实验期内没有死亡。对照组对虾在实验期内也没有死亡。感染结果表明病毒不是HPNS的主要病因。
2.3 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾细菌分离鉴定
从63尾具HPNS症状的对虾不同组织中分离鉴定49种细菌，分别属于10个属。所有这些细菌中，肝胰腺分离鉴定34种细菌，肠道31种，血淋巴39种(表2)。
其中弧菌属Vibrio10种，包括副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈维氏弧菌V．harveyi、溶藻弧菌V．alginolyticus、霍乱弧菌V．cholera、河流弧菌V．fluvialis、创伤弧菌V．vulnificus、弗尼斯弧菌V．furnissii、远青弧菌V．azureus、需钠弧菌V．natriegens、拟态弧菌V．mimicus；芽孢杆菌属Bacillus11种，包括蜡样芽孢杆菌B．cereus、解淀粉芽孢杆菌B．amyloliquefaciens、地衣芽孢杆菌B．licheniformis、苏云金芽孢杆菌B．thuringiensis、枯草芽孢杆菌B．subtilis、高地芽孢杆菌B．altitudinis、死谷芽孢杆菌B．vallismortis、巨大芽孢杆菌B．megaterium、弯曲芽孢杆菌B．flexus、韩国芽孢杆菌B．koreensis、南海恩施芽孢杆菌B．ensch；气单胞菌属Aeromonas7种，包括豚鼠气单胞菌A．caviae、嗜水气单胞菌A．hydrophila、维罗纳气单胞菌A．veronii、温和气单胞菌A．sobria、斑点气单胞菌A．punctata、舒氏气单胞菌A．schubertii、肠棕气单胞菌A．enteropelogenes；微小杆菌属Exiguobacterium5种，包括印度微小杆菌E．indicum、金橙黄微小杆菌E．aurantiacum、乙酰微小杆菌E．acetylicum、深海微小杆菌E．profundum、海洋微球菌E．marinum；葡萄球菌属Staphylococcus6种，包括沃氏葡萄球菌S．warneri、木糖葡萄球菌S．xylosus、巴氏葡萄球菌S．pasteuri、路邓葡萄球菌S．lugdunensis、松鼠葡萄球菌S．sciuri、腐生葡萄球菌S．saprophyticus；不动杆菌属Acinetobacter3种，包括约氏不动杆菌A．johnsonii、泛耐药鲍曼不动杆菌A．baumnnii、溶血不动杆菌A．heamolyticus；希瓦氏菌属Shewanella3种，包括脱色希瓦氏菌S．decolorationis、海藻希瓦氏菌S．algae、鲍希瓦氏菌S．haliotis；发光杆菌属Photobacterium2种，包括美人鱼发光杆菌P．damselae和鳆发光杆菌P．leiognathi；肠杆菌属Enterobacter1种，阿氏肠杆菌Enterobacterasburiae；假单胞菌属Pseudomonas1种，包括弯曲假单胞菌P．geniculate。
在63尾患病对虾中，38尾对虾中鉴定有副溶血弧菌V．parahaemolyticus，其余25尾没有分离到，占鉴定对虾总数的60.3%；有蜡样芽孢杆菌B.cereus的对虾34尾，其余29尾没有分离到，占鉴定对虾总数的54.0%；有苏云金芽孢杆菌B．thuringiensis的对虾20尾，其余43尾没有分离到，占鉴定对虾总数的31.8%；有霍乱弧菌V．cholera的对虾19尾，其余44尾没有分离到，占鉴定对虾总数的30.2%；有金橙黄微小杆菌E．aurantiacum的对虾14尾，占鉴定对虾总数的22.2%；有嗜水气单胞菌A．hydrophila的对虾11尾，占鉴定对虾总数的17.5%；解淀粉芽孢杆菌B．amyloliquefaciens的对虾为7尾，分别占鉴定对虾总数的11.1%；其他种细菌分别从一些HPNS单尾虾中分离鉴定(表2)。不同种类细菌可以从不同的单尾HPNS病虾中分离，单尾HPNS病虾中最多鉴定细菌9种，最少鉴定细菌3种。以上结果表明多种细菌可能与对虾HPNS爆发有关。
表2 63尾HPNS对虾肝胰腺、肠道和血淋巴中分离鉴定的细菌
2.4 肝胰腺坏死症凡纳滨对虾细菌人工感染
用副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌分别注射感染健康对虾，在感染后6d全部死亡，死亡率100%，表现典型肝胰腺坏死症状。对照组死亡率为12%，没有肝胰腺坏死症状(图2)。用副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌分别浸泡感染健康对虾，感染组对虾缓慢死亡，在感染后14d统计结果，VP+BT混合菌感染组对虾死亡率较高，达到75%，VP感染组对虾死亡率达到66%，BT感染组对虾死亡率为62%，感染组死亡对虾表现典型肝胰腺坏死症状。对照组死亡率为16%，没有肝胰腺坏死症状(图3)。
图2 副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌注射感染对虾的情况
图3 副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌浸泡感染对虾的情况
取不同感染方式感染对虾进行病毒PCR检测，未检查到病毒。感染对虾重新进行细菌分离和鉴定，V1感染组对虾中分离鉴定出副溶血弧菌，Z7感染组对虾中分离鉴定出苏云金芽孢杆菌，V1+Z7混合感染组分离鉴定的细菌有副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌，两种细菌都可以分别从人工感染对虾中对应重新分离。这些结果表明副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌都可以感染健康对虾产生HPNS症状。
分别用副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT以及两者的混合菌液VP+BT注射感染和浸泡感染健康对虾，病虾均能产生与对虾自然发病的HPNS症状：摄食减少或不摄食，肝胰腺萎缩，B、F、Ｒ细胞坏死(图4)。
图4 副溶血弧菌VP和苏云金芽孢杆菌BT感染对虾组织病理观察
a：苏云金芽孢杆菌BT浸泡感染对虾的肝胰腺组织切片观察；b：副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌混合菌浸泡感染对虾的肝胰腺组织切片观察；c：副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌混合菌注射感染对虾的肝胰腺组织切片观察
3 讨论
有报道采用PCR方法证明WSSV、YHV、IMNV和TSV等对虾病毒不是EMS的病因。在本研究中我们运用PCR方法检测HPNS病虾11种对虾病毒，只有WSSV和IHHNV2种病毒可检测出，但病毒人工感染对虾并没有产生HPNS。因此对虾HPNS不是由单一病毒引起的。
为了确定HPNS产生是否与细菌有关，我们采集63尾HPNS病虾进行细菌分离鉴定，细菌可以从每一尾对虾的肝胰腺、血淋巴和肠道分离，经鉴定，这些细菌属于10个属，没有单一的一种细菌可以从所有63尾HPNS病虾中分离。比如，副溶血弧菌只从其中的38尾对虾中分离到，蜡样芽孢杆菌从其中34尾对虾中分离到，苏云金芽孢杆菌从其中20尾对虾分离到，霍乱弧菌从其中19尾对虾分离到。我们选择副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌人工感染健康对虾，所有发病对虾均表现HPNS症状。结果表明HPNS产生与多种细菌种类有关。
为什么HPNS产生会与多种细菌有关呢?我们认为这要归结于水体理化因子和有毒藻类的胁迫。HPNS爆发与水体理化因子(如氨氮，亚硝酸盐等)密切相关。在氨和亚硝酸盐浓度较高的养殖池塘越容易爆发HPNS感染。如果爆发HPNS疾病，减料停料可以有效降低养殖水体氨氮浓度并有效控制疾病的产展(未发表数据)。如果养殖池塘有毒藻类爆发，HPNS也会产生(未发表数据)。在对虾养殖中，减料和/或减少养殖密度将降低HPNS爆发的风险，而且对虾和不同鱼类(罗非鱼、草鱼、胡子鲶等)混养可以有效改善养殖环境并且降低HPNS爆发的风险(未发表数据)。因此，我们认为对虾养殖生态系统平衡被打破是HPNS爆发的根本原因，养殖生态系统紊乱，导致条件致病菌大量产生和氨氮胁迫，对虾处于亚健康状态，多种细菌包括在非胁迫条件下不能感染对虾的细菌也可以感染对虾。环境胁迫及导致条件致病菌繁生的生态系统是对虾发生HPNS的根本原因。
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