红菇子实体多糖的提取及其抗氧化活性研究

多糖，又称多糖，是由醛糖或酮糖脱水形成糖苷键，由糖苷键直链或支链连接而成的链状聚合物。一般聚合度大于10，分子量为数万至数百万。多糖是构成生命活动的四种基本物质之一。它广泛存在于生物体内，与生命的各种生理功能密切相关。具有重要的保健和临床应用价值。目前，猪苓、香菇、灵芝、云芝等食用菌多糖的研究较多。红菇（Russula）是属于担子菌门、担子菌纲、红菇目、红菇科、红菇属的一类大型菌根真菌。红菇含有丰富的碳水化合物、蛋白质、氨基酸、维生素和人体必需的微量元素。它具有很高的营养和保健价值。近年来研究发现，红菇具有抗癌、降血糖、降血脂、提高免疫力、抗菌、清除自由基、修复甲醛氧化损伤等作用。闽北是著名的红菇产区（RussM如winosa Lindlad）。本文对福建红菇中主要活性物质红菇多糖的提取方法及体外抗氧化活性进行了研究，为福建红菇的进一步开发利用提供了理论依据。 1 实验材料1.1 材料红菇子实体购自武夷山。 1.2 试剂DEAE-cellulose购自美国Sigma公司；萘乙二胺盐酸盐、乙醇等试剂为分析纯（AR）；水是重蒸水。 2 实验方法2.1 红菇多糖的提取红菇子实体用流水冲洗去泥沙，60烘干至恒重，粉碎：再称取一定量的蘑菇粉放入锥形瓶中，加水提取，重复2减压过滤后，用旋转蒸发器浓缩；加入3倍体积乙醇，密封，静置过夜，离心，沉淀真空干燥得粗多糖。 2.2 红菇多糖的纯化将粗多糖溶于水，用Sevage法去除蛋白质，乙醇沉淀。沉淀抽滤干燥，依次用丙酮和乙醚洗涤，真空干燥得半纯红菇多糖。将多糖溶解于水中，吸滤，滤液置于I)EAE-纤维素层析柱(2.5cmx20cm)上，用0-1.0molL NaCl缓冲液梯度洗脱，测定各管洗脱液波长吸光度在280 nm 处，合并每个部分的洗脱液。 2.3 多糖含量及得率的测定多糖含量的测定：采用蒽酮-硫酸法测定，多糖得率（%）为粗多糖重量与子实体干粉重量的百分比值。 2.4 红菇多糖还原力的测定采用Ovaizu等人提出的还原三价铁离子_12J的方法测定红菇多糖的还原力。具体步骤如下：分别取pH值为6.6的磷酸盐缓冲液2.0mL和质量分数为0.1%的铁氰化钾溶液2.0mL，加入不同质量浓度的多糖溶液2.0mL，混匀，50水浴20分钟。快速冷却。再加入2mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液。混合均匀，3 000 rrain。离心10 min，取上清液2.0 mL，加入质量分数O2。加入0.4 mL 3%氯化铁，混匀，再加入2.0 mL蒸馏水，混匀，用蒸馏水调零，测量波长'700 lqnl 处的吸光度。抗坏血酸作为阳性对照，平行测定3次。 2.5 红菇多糖清除•OH 羟基自由基(•0H) H2O2 能力的测定采用Fenton 反应法生成。 '该体系通过芬顿反应可产生羟基自由基（•OH），其反应式为： H2O2+Fe2'—+•OH+OH+Fen 溶液中的邻菲咯啉-Fe。 '水溶液（红色）被氧化成邻菲咯啉-Fe”（变色），以测定OH量的变化，实现抗氧化剂清除自由基能力的测定[13]。精确测定pH 7.4 PBS 缓冲液2 .0 mL 和重蒸水8.0 mL，混匀制成空白参比管。准确测定邻菲咯啉溶液1.0 mL（5 mmolL），PBS 缓冲液2.0 mL，硫酸亚铁溶液（7.5 mmol1）1.5 mL和重蒸水5.5 mL，混匀制成无损管；依次准确测定菲咯啉溶液（5 mmol1）1.0 mL，PBS缓冲液2.0 mL，硫酸亚铁溶液（7.5 mmol]•I『_ ) 1.5 mL，H2O：(0.1%) 1.0 mL 和重蒸水4.5 mL，混匀制成破损管，依次准确量取邻菲咯啉溶液(5 mrilo]•L。

) 1.0 mL，PBS 缓冲液2.0 mL，硫酸亚铁溶液(7.5 mmol]• L.) 1.5 mL。 H，0，（0.1%）1.0 mL，加入不同浓度的多糖溶液和重蒸水共4.5 mL，混匀制成样品管，以抗坏血酸为标准抗氧剂，将上述试管置于同时在37恒温水浴中，60rain。用空白参比管调零，in。在536 nm处测定吸光度，计算羟基自由基清除率(d)。平行测定3 次。 d=舟Lu100% 式中：A，为样品管在536.nm处的吸光度； A：破损管在536rffn处的吸光度； A，未损坏管在536 nm 处的吸光度。 2.6 红菇多糖在体外模拟胃液条件下清除N02_的反应准确量取不同浓度的多糖溶液5.0mL置于25mL比色管中，加入pH 3.0的柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液5.0mL、5mg• L. NaN()溶液2.0 mL，37cIC恒温水浴1 h，加入0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL，摇匀，静置5 min。再加入1.0 mL 0.2%萘乙二胺盐酸盐，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15 min。在540 nrn 测量其吸光度。用抗坏血酸作为对照。清除率的计算公式为：E=0-A]Mo1000A， (2) 式中：E为清除率；是不添加多糖时测定的NaN ( )。吸光度； A为NaN()的吸光度：加入多糖时测得。 3 结果与分析3.1 红菇多糖提取正交试验选取水料比、提取时间、提取温度为对多糖提取影响较大的三个因素，按L9（3.）不计三因素三水平试验（表格1）。测试结果如表2所示。

由表2中极差分析结果可知，各因素对红菇多糖得率影响的主次顺序为：A>C>B，即水料比对多糖得率的影响最大．浸提时问比水料比的影响稍小，浸提温度的影响最小。各极差结果有A因素列为为>K：>Kl，B因素列为K。>K，>K，，C因素列为K，>K：>K。从实验结果分析得出较优方案为：A381C3，即水料比为30，浸提温度60％：，浸提时间3 h。在此提取条件下，多糖得率为4．326~A，。从水料比因素中最好的水平是A3，温度最好的水平是B，，浸提时间最好的水平是C，，这三个水平组合起来即A。B，C，，这正好是实验号7的实验条件，所以可以确定凡BI(：，是最优方案。在这个条件下做验证实验得到的实验结果是多糖得率为4．335％，因此取平均值红菇多糖得率为4．33％。3．2粗多糖的糖含量分析    以蒽酮一硫酸法测定，得到糖浓度含量z(g)与吸光度y之问的线性方程y=0．0065z+0．0014，相关系数R。=0．9994．由此计算出粗多糖的糖含量为(45．83-+0．54)％。3．3红菇多糖的纯化    粗多糖经Sevag~j法去蛋白、：DEAE一纤维素阴离子交换柱层析．分段洗脱后得到4个吸收峰D。、D：、D，和D。，经蒽酮一硫酸法检测均为多糖。其中D。组分多糖含量最高，其次为D。、D，，D：组分多糖含量最少。洗脱曲线如图1所示。图l红菇粗多糖的DEAE一纤维素阴离子交换柱层析洗脱曲线3．4红菇多糖还原力的测定    红菇多糖的还原力测定结果见表3和表4。    从表3测定结果可以看出，红菇多糖具有一定的还原力．且随着剂量的增加，还原力逐渐增强。但与Vc相比，其还原力较弱，红菇多糖剂量为125斗g•mL。时的还原能力才与3．75¨g-mIJ_‘的Vc相当(p>0．05)。由表4可知．不同剂量的红菇多糖组分具有一定的还原力，且随着红菇多糖组分剂量的增加，其还原力逐渐增强。在相同剂量下，不同红菇多糖组分的还原力大小依次为D。、D，、D：、D。。其中D，组分还原力较红菇粗多糖弱。D。、D，、D2组分的还原力优于红菇粗多糖，在剂量为12．5g•mL。时，超过粗多糖75 pg•mIJI’时的还原力。但与Vc相比，其还原力较弱。D。、D，、D。、D．组分的还原力分别为同剂量Vc的27．62％，、17．62％、12．38％、1．．35％，。3．5红菇多糖清除羟基自由基(•OH)的能力测定    红菇多糖清除•OH试验结果见表5、表6。    从表5可以看出，红菇多糖和Vc对•0H均有清除作用，在50斗g•mL『‘～800斗g•mL一。之间随着剂量增加，清除率明显上升，特别是剂量从400斗g•mI。。增到600“g•m一时，清除率从22．95％，跃升到65．32vA，：此后随着剂量的增加，清除率缓慢上升，当剂量增加到800g•mL’。时，清除率达到最大，为77．66~A，。而Vc溶液在该剂量范同内清除率在4．97％～72．06％之间，也随着剂量增加而增加。    当红菇多糖剂量增加到600斗g•mL一和800g．mI．-一时，清除率优于Vc(P<0．01)，剂量增加到1 000g•mL。时清除率与同剂量Vc相当，无显著差异(p>0．05)．说明红菇多糖对•0H具有良好的清除作用。    不同红菇多糖组分对•0H的清除效果如表6所示．不同剂量的红菇多糖组分对芬顿体系产生的•OH自由基均有一定的清除作月{，且随着红菇多糖组分剂量的增加，其清除效果逐渐增强。在剂量为25斗g•mL。时，D，、D：、D，、D。对•0H的清除率分别是4．630A，、39．80％、28．51％和53．13％．以D。对•0H的清除效果最佳。在低剂量时，纯化后的多糖对•0H的清除效果优于粗多糖及Vc。其中D．组分在剂量为100“g•Ⅱ1L『、对对•0H的请嘛警分销是同剞量粗多糖的3．78倍，Vc的1．71倍；而D。D，、D。组分在使用剂量为25¨g•m一时，对•0H的清除率均超过粗多糖400“g•mL。时的清除率；在该使用剂量下，D：、D，组分对•0H的清除率超过vc为200斗g•mL。时的清除率(20．44％)，眈组分对•OH的清除率超过50％，超过Vcz400斗g•mL“时的清除率(48．45N，)。由此可知D。具有很强的清除•0H的活性。3．6红菇多糖在体外模拟胃液的NO，清除反应    亚硝酸盐(N0：一)是亚硝胺的前体物，亚硝胺是人和动物的强致癌物，它能引起人体和动物的肝脏等多种器官的恶性肿瘤。通过消除体内的N0：，可以明显减少患癌的比率m J。实验结果如表7所示。表7红菇粗多糖在体外模拟胃液条件下对N0f的清除效果    由表7测定结果可见，红菇粗多糖和Vc均能有效清除N0：一，且随着剂量的增加，清除率呈现出明显的梯度变化。红菇多糖剂量从125斗g•mL。增至375¨g•mL。时，清除率显著增加，当用量达到375¨g•mL。时，清除率达到最大45_3％，再增加多糖的剂量时，清除率反而下降。而Vc剂量为125¨g•mL。时，清除率即超过50％，，能显著清除N0：一，且随着Vc剂量增加，清除率增大：Vc的清除率显著高于同剂量的红菇粗多糖(p<0．01)。    不同红菇多糖组分在体外模拟胃液条件下对N0，一的清除效果不同，D。组分在体外模拟胃液条件下对N0，一有一定的清除作用，且随着多糖剂量的增加，清除率呈现出明显的梯度变化；在剂量为100¨g•mL。时，D。组分对N0：一的清除率超过粗多糖在125斗g•mI。。时的清除率。但较Vc弱。其余各组分对N0，一均无清除作用。4讨论    许多研究表明食用菌类的多糖对ROS具有清除作用．能减少脂质过氧化产物的生成量，增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶f(；St{一Pxl活性，具有良好的抗氧化性能，且毒副作用小，是具有清除自由基和代谢调节作用的天然物质。从正红菇子实体中提取得到红菇粗多糖，经脱蛋白、【)EAE一纤维素阴离子交换柱层析分离得到D，、D：、战和D。四个组分。    实验结果表明，红菇粗多糖及其各组分具有一定的还原能力，对芬顿体系产生的•0H有较好的清除作用，在体外模拟胃液条件下对N0：一有一定的清除效果，说明红菇多糖具有一定的抗氧化作用。与Vc相比，红菇多糖在还原能力和清除N0：的能力要弱很多，而在清除•0H方面却显示了极强的能力。尤其是D。组分，在极低的浓度下(25 g-mL。)对•OH的清除率超过50％，超过Vc浓度400恤譬•m一时的清除率(48．450A，)。    上述实验表明，红菇多糖的开发利用为真菌多糖提供了新的材料和数据，为筛选抗氧化药物提供了理论依据，并可为红菇的进一步研究和开发利用提供依据。