菌种冷冻干燥保藏法

(1)准备安瓿管。用于保存冻干菌种的安瓿管应采用中性玻璃制成。形状可为长颈球底，又称泪滴形安瓶管（图VII-15），尺寸要求外径6—7.5mm，长105mm，球径9—11mm，壁厚0.6 -1.2 毫米。也可以使用没有灯泡的管状安瓿。插入棉塞，1.05kg/cm2，121.3灭菌30分钟，备用。 (2)准备菌种。采用冷冻干燥法保存的菌种，可保存数年至十年以上。为了多年以后不出错，要特别注意所用菌种的纯度，即不能有细菌污染，然后在最适温度下在最适培养基中培养，才能产生良好的培养物。细菌和酵母的年龄要求超过对数生长期。如果使用对数生长期的菌株进行保存，反而会降低存活率。一般来说，细菌需要培养24-48小时；酵母需培养3天；形成孢子的微生物应该保存孢子；放线菌和丝状真菌需要培养7-10天。 (3) 菌悬液的制备及分装以菌液为例，在倾斜试管中加入约2ml脱脂牛奶制成浓缩菌液，分装0.2ml每支安瓶管。 (4)冻干机成套销售，价格昂贵。以下是可以达到相同目的的简单方法和设备。在低温冰箱中冷冻分装安瓿。如果没有低温冰箱，可以使用干冰（固体CO2）酒精或干冰丙酮等制冷剂，温度可达-70。将安瓿管插入冷媒中，冷冻4-5分钟，使悬液凝固。 (5)真空干燥为使样品在真空干燥时保持冷冻状态，需准备冷冻罐，罐内放入碎冰块和食盐，混匀，冷却至-15即可摄氏度。仪器仪表如图VII-16所示，安瓿管置于冷冻槽中的干燥瓶中。一般在30分钟内能达到93.3Pa（0.7mmHg）的真空度，被干燥物不会熔化，然后继续抽气。数小时内可观察到被干燥物变干，一般抽至26.7Pa（0.2mmHg）的真空度，保压6-8小时。 (6)封口抽真空干燥后，取出安瓿管与玻璃管连接封口。用L型五通管继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。在真空状态下，用煤气灯的细火在安瓶瓶颈中央封口。密封后，存放在冰箱或室温避光处。该方法是保存菌种最有效的方法之一。适用于一般生存力强的微生物及其芽孢和非芽孢菌，甚至适用于一些难以保存的致病菌，如脑膜炎球菌、淋病菌等。等也可以保存。适用于菌种的长期保存，一般可保存数年至十年以上，但设备和操作相对复杂。