1 食用菌遗传育种技术1.1 人工选择育种人工选择育种是指利用自然界中生物的自然选择规律，人工选择自然条件下发生的有益变异，使有益变异不断积累和遗传，从而获得人类需要。新物种的形成过程。新品种如“北京猴头菇1号”（陈文亮，1988）、Pleurotus nebrodensis (Inz.) Qul。通过人工选择获得。人工选育的基本方法是采用组织分离法和孢子分离法获得纯菌株，并不断纯化获得优良菌株。为使人工选育有效，需要对我国丰富的食用菌野生资源的种属（包括外部形态、生理习性、营养价值、遗传特性）进行全面、系统的调查、采集、分离、保存和研究和栽培品种。 1.2诱变育种诱变育种是利用物理诱变剂（包括非电离辐射紫外线、激光、离子柱和X射线、射线和引起电离辐射的快中子等）和化学诱变剂（烷化剂、碱、等)基类似物、吖啶类化合物)处理细胞群体，显着增加其基因突变，然后从差异群体中筛选出符合育种目的的突变体。诱变育种具有速度快、方法简单等优点，是菌株育种的重要途径。 1.2.1 紫外诱变紫外诱变育种是一种较为简单的诱变育种方式，最适宜的诱变对象是单细胞单核个体。李德顺等。等(2002)利用紫外诱变对平菇“山大1号”菌株的担子孢子进行处理，获得了理想的新菌株。此外，姬松茸（张辉等，2004）、灰树花（Fr.）S.F.的突变株。灰色(Xu Zhixiang et al. 2004), Hericium spp. （李彦宏，李力，2006）等。 1.2.2 辐射育种辐射育种是利用射线等射线诱导作物基因突变以获得有价值的新突变体，从而培育优良品种。夏芝兰等。 (2004) 使用60Co- 射线诱导杏鲍菇(DC.exFr.) Qul 的诱变。菌丝，经拮抗作用试验和酯酶同工酶电泳验证，筛选出一株杏鲍菇新菌株。用该方法培育出的姬松茸新菌株，经液体培养后，其胞外多糖产量比原菌株提高了12%（张辉，童俊生，2003）。 1.2.3 激光诱变激光诱变育种是1960年代前苏联兴起的一种育种技术。其原理是利用激光作用于生物体时产生的压力、热效应、电磁效应及其综合效应，使生物巨大。分子变化，进而导致遗传变异。激光诱变育种作为现代农作物育种技术的一项高新技术(李万云、李涛，2006)，以其正突变率高、遗传稳定性好等优点，被应用于食用菌育种研究。目前已利用氦氖激光诱变获得遗传稳定性好的香菇菌株(张晓丽等，2000)和金针菇高产SOD菌株(李耀伟等，2002)。 1.2.4 离子注入离子注入诱变是利用离子注入设备产生高能离子束注入生物体内，使遗传物质发生永久性改变，然后从突变菌株中选育优良菌株的方法。目前，该技术在我国食用菌育种中应用较少。傅永谦等。等（2005）尝试利用低能离子束诱变培育阿魏冷菇高产多糖菌株，并取得了初步结果。 1.2.5 空间诱变空间诱变育种是指利用返回式卫星或高空气球将农作物种子带入太空，使其在太空特殊环境（太空宇宙射线、微重力、高真空、弱磁田间等）生物染色体畸变，进而导致生物体发生遗传变异，是通过地栽培育新种质、新材料，培育新品种的农作物育种新技术。目前，我国已开展了香菇、平菇、黑木耳、金针菇、灵芝等食用菌的空间诱变实验（贾建航，卞银兵，1998）。在诱变育种中，起始菌株的选择、诱变对象的状态、诱变剂的使用和用量都会影响诱变效果。
一般而言，选育已自然选育并应用于生产，性状稳定，综合性状优良，仅选择个别缺陷的菌株，使其处于单细胞均匀悬浮状态，并根据辐射敏感性和各种性质的食用菌。不同剂量下的突变频率决定了诱变剂的用量，从而达到理想的诱变效果。 1.3 杂交育种杂交育种技术是食用菌新品种选育中应用最广泛、效果最好的育种方法。其原理是通过单倍体交配实现基因重组，从杂交后代中选出具有双亲优良性状的品系。 20世纪80年代以后，杂交育种技术在我国食用菌育种研究中得到广泛应用。我国香菇生产中90%以上的菌种来源于单孢杂交育种（谭琪等，2000）。最近，通过单孢子杂交获得了一株优良的双孢蘑菇高产菌株（何建超等，2006）。此外，为了克服金针菇产生的无性孢子的干扰Curt. Fr. （唱）在有性杂交方面，研究人员利用多孢子杂交技术培育出金针菇主种“杂交19号”等（郭美英，1993）。在杂交育种中判断杂种的真伪，必须对亲本进行标记。对于异宗配种，由于自交不亲和，父母本身的性别可以作为标记。目前，食用菌的杂交育种也多适用于异联生种。 1.4 原生质体融合育种技术食用菌遗传背景复杂，加上常规育种方法的局限性，越来越不能满足人们对新品种的需求。基于细胞工程发展起来的原生质体融合技术是农作物和食用菌遗传育种方法的重大突破。该技术是不同遗传类型的原生质体在融合剂（或电场）的诱导下发生融合，实现部分或全部基因组的交换和重组，从而产生新品种的过程。由于原生质体融合育种是在没有性生活史的情况下实现基因重组或有性杂交的育种方法，与常规杂交育种方法相比，受亲缘关系影响较小，使得种间遗传差异远，属间甚至科间以上的杂交成为可能。 20世纪70年代，裂褶菌原生质体的成功制备，使得应用原生质体融合技术进行食用菌育种成为可能(DeVries、Wessels，1972)。Zhao et al.(1995)利用PEG法和电融合法获得了Coprinus cinereus和Schizophyllum commune种内不同菌株间的融合子，但是随后进行草菇属Volvariella种间原生质融合实验，AP-PCR鉴定融合子未发现双倍体现象(Zhao et al.，1997)。在我国，潘迎捷等(1991)获得了香菇种内原生质体融合菌株，随后研究人员在平菇属和香菇属间(刘振岳、赵世民，1991)、蘑菇属和口蘑属间(张功等，2005)进行原生质融合育种实验，取得了一定的效果。值得一提的是肖在勤等(1998)用该方法，获得了金针菇和凤尾菇不同科间的具有双亲优良性状的融合菌株“金风2-1”，并用于生产。目前研究人员也努力用原生质体融合技术试图解决难栽培，市场需求量很大的外生菌根真菌松茸的育种(王淑珍等，2003)。 原生质体融合育种的困难就是融合子的鉴定问题。可以用于融合子鉴定的标记有形态标记如有无锁状联合、同功酶分析、生长拮抗试验、出菇实验及担孢子分析。然而锁状联合只是被发现在一些融合率很低的种间融合子(Toyomasu & Mon，1989)，而在种内的2个不亲和的单核亲本的融合子不一定产生锁状联合(林芳灿，1991)；同功酶分析要依靠生化位点的建立，耗时而且受生理环境的影响；出菇实验是鉴定融合子最好的证据，但是也不排除单核子实体；原生质体单核化可以为鉴定融合子提供一条途径，但是过程复杂(Zhao & Chang，1993)。因此，应用原生质融合育种技术尚需找到更可靠的鉴定融合子的方法。 1.5 基因工程育种(转基因育种) 基因工程育种技术是指人为从某一供体生物中提取所需要的目的基因，在离体条件下用适当的酶切割或修饰，然后将其与载体DNA分子连接起来一并导入受体细胞中进行复制和表达，从而选育出新物种。它为食用菌，尤其是为那些常规育种手段受到限制的种类育种开创了新的途径。 遗传转化和表达系统的建立是基因工程育种的一个重要环节。1986年Mufioz-Rivas等利用PEG法把同源的trpC基因转入裂褶菌色氨酸营养缺陷型突变株中，获得正常的裂褶菌菌株，这为后来的食用菌遗传转化育种奠定了基础。但是随后进行的大肠杆菌潮霉素B转磷酸酶标记基因(hpt)在双孢蘑菇中的转化受到了严重的甲基化(Mooibroek et al.，1990)。研究人员用PEG法、电激法、基因枪法等各种方法，介导外源DNA到双孢蘑菇原生质体、菌丝、子实体中试图建立一个稳定的转化体系，但都因为供体DNA进入受体后不稳定、重组率低、甲基化严重或者在异源启动子作用下不能充分表达而没有成功(Challen et al.，1991；Royer et al.，1991；Li et al.，1993)。1996年，Van de Rhee et al.通过电融合法将大肠杆菌抗潮霉素基因转入腺嘌呤营养缺陷型的双孢蘑菇同核体菌株中，成功地获得了稳定的双孢蘑菇转化体系。但是这个转化体系对异核双孢蘑菇或其它的食用菌转化是否可用，当时存在争议(Stoop & Mooibroek，1999)。1998年，De Groot et al.利用农杆菌(Agrobacterium)介导转化丝状真菌包括双孢蘑菇，结果表明转化效率很低尽管该方法简便易操作。Chen et al.(2000)在前人的基础上对农杆菌介导转化的方法作了修改，通过子实体菌褶组织与农杆菌共培养在同源启动子的作用下实现了双孢蘑菇的高效转化。Leach et al.(2004)利用农杆菌介导大肠杆菌抗潮霉素标记基因转化双孢蘑菇获得较理想的结果，但同时也发现酚、乙酰等诱导的毒性对整合到双孢蘑菇基因组的转化基因有毒害作用。除了双孢蘑菇外，目前仅有少数食用菌包括侧耳(Herzog et al.，995)、香菇(Hirano et al.，2000；闫培生等，2002)、金针菇(Kuo et al.，2004)进行了类似的遗传操作，但还没有建立起相对稳定的转化系统。 2 新型种质鉴定技术 在食用菌育种工作中，如何选择和有效的鉴定出符合目标的菌株，以及对优良菌株的保护是非常重要的。传统的鉴定方法是依靠菌株的形态、生理、生化等特征，然而很多时候形态特征不明显(出菇实验耗时)或受环境影响不可靠，因为没有统一的鉴定标准，给下游的栽培带来选择困难。 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接反映分子标记，是DNA水平遗传变异的直接反映。与以往的遗传标记相比，分子标记具有独特的优越性：大多数分子标记是共显性遗传，对隐性农艺性状的选择十分便利；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；而且基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的(马富英、罗信昌，2002)。随着分子生物学技术的发展，目前已经发展出了几十种基于DNA多态性的分子标记，如随机扩增多态性(RAPD)、限制性片段长度多态(RFLP)、基于Southern杂交和基于PCR的扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列长度多态性(SSLP)、序列标记位点(STS)、单核苷酸多态性标记(SNP)、特征片段扩增区域(SCAR)、核糖体DNA(rDNA)重复序列等。其中以RFLP、RAPD标记较为广泛地应用于食用菌的菌株的鉴定，遗传多样性、亲缘关系分析、种质资源评估、遗传图谱构建及基因定位和克隆等研究领域中，AFLP的应用也有少量报道。 2.1 RFLP标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)即限制性片段长度多态性，其基本原理是生物在长期进化过程中，在属、种乃至品种间同源DNA序列中的某一位点上，由于发生插入、缺失、倒位、易位或单碱基突变等造成该处限制性内切酶识别位点的增加或减少，因而供试菌株DNA经酶切、电泳、Southern杂交会产生不同长度的多态性，显示不同的带型，而这些带型是鉴别品系，分析类缘关系，验证遗传分离的科学证据。 上世纪80年代，该技术就在对栽培蘑菇品系与野生物种间的类缘关系分析中得到很好的应用。Molina et al.(1992)用PCR-RFLP对斗菇Lentinus spp.和香菇Lentinula edodes的18SrDNA和1TS1-5.8SrDNA-ITS2区域进行分析，所有的香菇菌株的限制性图谱相同，而与斗菇的有明显区别，支持将香菇从斗菇属中分出来而独立成香菇属。李英波等(1995)对野生和栽培香菇菌株做了RFLP指纹图谱分析，表明遗传分离普遍存在于菌株间而与地理分布没有很大相关性，提示在育种工作中选择亲本时应根据菌株间的遗传分离，而不是单纯以地理位置的差异来选择亲本。Xu et al.(2002)利用核基因和线粒体基因的RFLP及多位点酶电泳多肽分析了双孢蘑菇自然居群的遗传多样性，指出法国不同分布区的2个双孢蘑菇居群都存在很高的遗传多样性。Bao et al.(2004)利用26SrDNA-RFLP研究来源于亚洲的侧耳属34个菌株，阐述了侧耳属不同生物种间的系统进化关系。张金霞等(2004)以IGS2-RFLP为分子标记，对中国栽培的白灵菇不同品种进行了鉴别。余志晟等(2005)应用RFLP技术对12个草菇栽培菌株的核糖体、线粒体和基因组总DNA的多态性进行了研究，结果表明供试菌株间遗传差异很小，为草菇的育种提供资料。 2.2 RAPD标记 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA，是由Williams和Welsh(1990)发展起来的。它是建立在PCR技术基础上，利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD分子标记以其操作简单、快速、信息量大、经济等优点而被广泛应用于杂交亲本的选择、杂合子或融合子鉴定及遗传相关性分析上。但RAPD随机扩增引物的选择和数量是十分关键的环节，不同的引物或引物选择数量的多少将直接影响分析的结果。运 用RAPD技术对杂合子或融合子与其亲本进行聚类分析和相似系数分析，可以判断杂交或融合是否成功。曾荣、刘组同(1999)应用RAPD技术结合同工酶分析检测到虎纹斗菇Lentinus tigrinus和金针菇Flammulina velutipes属间融合子，而凤尾菇和金针菇科间融合子菌株“金凤2-1”也是用RAPD标记检测出的(肖在勤等，1998)。 Yan & Jiang(2005)将RAPD遗传距离作为选择单核亲本的指标，用于Stropha riarugoso-annulata杂交育种中，并认为根据RAPD遗传距离与杂合子的菌丝生长率的相关性，可以预测杂合子的表型。Moore et al.(2001)应用RAPD技术分析了26个双孢蘑菇菌株，结果表明来源于6个不同公司的24个菌株间相似性很高，而与2个广泛栽培的菌株间有明显的差异。 Ramírez et al.(2001)对用于栽培的商业化双孢蘑菇的菌株进行了RAPD多态性分析，结果检测到所有分析的菌株间同源性很高，并且选择出了一个与农艺性状“蘑菇重量”相关的DNA标记。Shnyreva et al.(2003)用RAPD标记结合同工酶电泳技术对俄国广泛栽培的侧耳和双孢蘑菇菌株做了分析，结果显示侧耳表现出很高的遗传多样性，而双孢蘑菇不同菌株之间相似性却很高。在我国，张金霞等(2004)以RAPD为分子标记，研究了中国栽培白灵侧耳菌株的遗传多样性，结果显示供试的侧耳菌株间遗传多样性很高。邓旺秋等(2004)利用RAPD标记对广东省8个草菇主栽菌株的亲缘关系和遗传多样性进行研究，获得了草菇不同菌株的DNA指纹图谱，为草菇商业菌株的鉴别提供了快速有效的技术手段，同样的方法也被用于不同木耳菌株的准确鉴定(闫培生等，2000)。 RFLP、RAPD分子标记除用于菌株的鉴别、遗传多样性分析外，还可用于食用菌的遗传连锁图谱的构建、基因定位和克隆以及线粒体遗传等研究。目前应用RFLP、RAPD、rDNA重复序列及同工酶及表型标记已经构建了双孢蘑菇、糙皮侧耳遗传连锁图(Larraya et al.，2000)。最近又得到了二极交配型Pholiota nameko的不亲和性相关蛋白基因(Hox1)的连锁图(Aimi et al.，2005)。 在RAPD、RFLP基础上逐渐发展起来的AFLP、SCAR也开始用于食用菌的品系鉴定(Kazuhisa et al.，2004；吴学谦等，2005)
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