双孢菇制种技术

1、孢子分离法蘑菇孢子分离法是利用成熟子实体的有性担子孢子从子实体层自动排出的特点，在无菌条件下，在适宜的培养基上使孢子萌发成菌丝。一种获得纯种马的方法。孢子分离可分为单孢子分离和多孢子分离两种方法。由于纯菌丝体是从有性担子孢子中分离出来的（即核已核结合），生产中常采用多孢子分离法。保持菌株原有特性，单孢子分离法主要用于菌株筛选和杂交育种。孢子分离主要分为两个步骤，第一是收集孢子，第二是分离单个或多个孢子。

(1) 采集孢子

1、种菇的选择要采集孢子，首先要做的是选择种菇，即子实体进行分离。一般栽培菇的要求是头鲜菇、早出菇、单生、个体强壮、子实体典型。仔细观察筛选后，在菇床做个记号，让蘑菇充分生长，直至即将折断。拍摄时，采摘蘑菇进行孢子喷射。

2. 孢子喷射收集蘑菇采收后，可用0.1%汞溶液浸泡一分钟左右杀菌，用镊子取出，用无菌水冲洗数次，然后用无菌滤纸吸干表面水分，或直接用75%酒精棉球轻轻擦拭瓶盖和菌柄进行表面消毒。然后用无菌刀剪掉多余的菌柄（约1.5-2cm即可），将蘑菇直立，菌柄朝下，插入铝丝制成的支架中，放入准备好的无菌滤纸中将钟形罩放在条带顶部（如图所示）。孢子收集集需要预先高压灭菌。将带有子实体的孢子喷射收集器置于温度为15-20的室内，约24-48小时后，无菌滤纸上可见褐色蘑菇孢子。在无菌操作下，将采集蘑菇孢子的滤纸条放入无菌空试管中，高温真空干燥，然后放入冰箱长期保存备用。

(2) 孢子分离

1、多孢子分离法是将多个孢子接种在同一培养基上，让它们一起萌发生长，交错在一起，从而获得纯种。由于多个孢子之间的物种互补，基本可以保持亲本的稳定性，这种方法比较简单，在过去的蘑菇制种中得到广泛应用。

(1)斜面划线法：按无菌操作规程，用无菌接种环从接受孢子的滤纸条上蘸取少量孢子，在斜面培养基上自下而上划线。 PDA 试管。请勿用力，以免划伤介质表面。接种后取出接种物烧试管口，用棉塞塞住，置于24恒温培养箱中培养。孢子萌发后（一般15-20天左右），选择萌发快、生长旺盛的菌落转移到新的试管培养基中进一步培养。

(2)包被分离法：按无菌操作方法，取一小张带孢子的滤纸，放入盛有无菌水的小三角瓶中，摇匀制成孢子悬液，然后用灭菌器试管，吸取孢子悬液，滴1-2滴于PDA试管或培养皿的培养基上，旋转试管使孢子悬液均匀分布在斜面上，或用玻璃包衣棒涂抹将悬浮液均匀涂抹在平板上。孢子在24恒温培养基上萌发后，选出少数发育良好、生长快的菌落，转移到另一试管斜面培养基中，恒温培养为母种。

2、单孢子分离是将收集到的孢子群单独培养，使其萌发成菌丝，获得纯种的方法。单孢分离法按分离手段可分为以下三种。

(1)稀释分离法：将孢子悬液不断稀释，控制孢子分散液的最终孢子浓度在300-500个孢子/ml，吸取0.1ml孢子液注入平板中均匀铺展，分散的孢子发芽形成单细胞。孢子菌落，其步骤如下：

无菌水试管的制备： 取10支试管，其中一支装有100毫升蒸馏水，另外9支装有9毫升蒸馏水。

孢子悬液的制备：取一小张收集有孢子的滤纸，浸入10ml无菌水试管中，振摇使孢子分散成悬液，用1ml无菌移液管吸取1ml孢子悬液于将第二支试管摇匀，然后从第二支试管中吸取1ml注入第三支试管中，重复稀释至孢子浓度达到300-500个孢子/ml，备用。

培养基板的制备：制备PDA培养基，放入锥形瓶中高压灭菌，准备好高压灭菌后倒板的培养皿备用。待灭菌后的PDA降温至50-60时，将15-20ml的PDA倒入菌操作下的培养皿中，将培养皿放平，使培养基表面光滑，厚薄均匀。

孢子包被：无菌操作下，吸取0.1 ml孢子悬液滴于平板培养基表面，用T型棒将孢子均匀涂抹在平板上，盖上刺激菌丝培养皿，置于24 在-25C 培养箱中培养。

选择单孢萌发菌落：一般孢子培养5天后开始萌发并长出菌丝，在显微镜下检查培养皿，确认孢子萌发菌落是由单个孢子萌发和生长形成的，即可以用打孔器打孔将菌落转移到新鲜的PDA斜面试管中继续培养。打孔器的外径应小于显微镜的视野，打孔前要检查菌落周围是否有孢子或其他菌落，打孔时不要碰到周围的孢子或菌落，以保证物种纯正.

(2)毛细管法：将孢子悬液稀释后，用毛细管滴管滴一小滴孢子悬液到皿盖中，使每一滴只含有一个孢子，从而实现单个孢子分离。方法如下：

孢子悬液的配制同稀释分离法，孢子浓度控制在200-300个孢子/ml。

毛细管滴管准备： 取一根干净的玻璃管，在酒精喷灯上拉成外径为1mm的细管，冷却后加热，迅速拉伸，使管尖内径约为200微米，剪下来做成毛细管滴管，滴管后端塞棉花，放入消毒盒内消毒备用。

样品显微镜检查：用毛细管移液管吸取约0.1ml稀释后的孢子悬液（可滴30滴），在无菌操作下，快速点在皿盖内壁标记圆圈的中心。液滴应小于低倍显微镜的视野，取样后的培养皿仍用水琼脂覆盖在培养皿底部，用胶带固定，然后用低倍磨刀器检查盘盖内壁上的液滴，确定是

   ④培养基推贴及刺激培养：使用接种针取一小块PDA培养基(约2×2毫米方块) 推贴至标记为单孢子的液滴,使液滴中的孢子能够吸附到培养基边缘。 将事先培养好蘑菇气生菌丝的平板培养皿盖取下，套在菌丝平板的底部，再把已分离并推贴好的培养基的皿盖罩在套有菌丝平板的玻璃皿上，使两个皿盖对接，贴胶布封口(要留0.5厘米缝用作通气),这样就形成一个刺激单孢子萌发的培养室,置培养箱中24 ℃下培养,待单孢子萌发,及时撕下胶布,用接种铲挑取已萌发的单孢菌丝贴块,移接到新鲜PDA斜面试管中,置24℃恒温箱中培养,即可区得单孢纯种。

  （３）器械分离法：应用显微操作器，直接挑选单孢子，移至PDA 平板中进行孢子刺激萌发培养,获得单孢纯种。

   ①孢子悬浮液制备：同稀释分离法，孢子浓度控制在1000个/毫升;

   ②平板涂布:将稀释后的孢子悬浮液滴0.1毫升于平板上,用无菌的T氏棒进行均匀涂布,每个平板含孢子大约100个左右;

   ③镜检分离:待涂布均匀的平板琼脂表面水分干燥后即可于显微镜下观察,当在视野中心见到孢子,而视野周围无其它孢子时,可用显微操作器操纵玻璃针把孢子从培养基表面挑取,随后把孢子转移至PDA平板的表面上,进行孢子萌发培养,孢子萌发培养须使用蘑菇气生菌丝刺激培养,才能提高萌发率,培养的具体操作方法与涂布分离法相同。

  （４）单孢子菌落接待：当孢子经过10天的刺激培养, 肉眼可见到菌丝生长而成小菌落,应及时用打孢子器把该菌落分离,每天都应观察孢子萌发情况, 如果不及时把菌落移接,该菌落会快速生长而影响较迟萌发单孢子的分离。

   二、组织分离法

　组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯菌丝的方法。组织分离系一种无性繁殖法，双亲的染色体没有经过重组，因此组织分离基本上可保持亲本的生物不特性，棒操作简便，取村广泛，在过去传统的稳定菌株中常采用此方法进行菌种的分离，退化不明显，但是随着蘑菇杂交菌种的应用，由于杂种本身所具有的不稳定，组织分离常造成菌株的退化，目前生产上很少采用，只是进行野生菌株分离时，才比较常用。其方法如下：

   ①挑选种菇：其标准与孢子收集要求相同；

   ②菇体消毒：将子实体菌柄基部切除,置接种箱内,用75%酒精对菇体表面进行消毒;

   ③组织分离:解剖刀经火焰灭菌,在菇柄中部纵切一刀, 用手掰开菌再用接种铲在菇盖与菇柄交界处切五个小方块,随后挑取一小块组织,迅速移接到PDA斜面培养基上,置24℃下培养,待组织块长出菌丝无污染即为纯种。