报告题叶绿体DNA分析技术及其在板栗中的应用

摘要： 被子植物叶绿体DNA是母系遗传的，具有独立的进化路线。基于叶绿体DNA的分析技术在分子系统学、资源多样性评价和杂种鉴定中发挥着重要作用。板栗资源丰富，分布广泛。本文综述了板栗叶绿体DNA分析技术的研究进展，阐述了PCR-RFLP、DNA杂交、叶绿体SSR标记技术、叶绿体基因片段测序分析技术等分子标记技术的原理、特点及应用。在板栗中的应用。并对未来如何开发板栗植物叶绿体DNA标记进行了展望。关键词：板栗；分子标记；叶绿体SSR标记； PCR-RFLP标记；叶绿体基因片段测序分析技术396-04 壳斗科[Castartea (Tourn.) L.]植物广泛分布于欧洲、亚洲和北美洲的温带地区，是世界重要的果树作物之一。板栗的种类和种类很多。 Johnson 将板栗分为7 个种：板栗(C.mollissima B1.)、板栗(C.seguinii Dode.)、板栗[C.henryi (Skan) RehderWilson]、日本板栗(C.crenata Sieb.Zucc.)。 )、欧洲板栗(C.sativa Mill.)、美洲板栗[C.dentate (Marsh.) Brokh]、榛子板栗(C.pumila Mill.)。亚洲分布有4种，分别是日本和朝鲜半岛的日本板栗，以及我国的特有种——板栗、板栗、板栗。我国是板栗遗传多样性中心，板栗是板栗的乡土品种，分布广泛，对板栗枯萎病的抵抗力强。欧洲板栗仅分布于欧洲，土耳其东部是其次要起源和遗传多样性的中心。美洲栗子和榛子产于北美洲。近年来，随着分子标记技术的快速发展和广泛应用，利用叶绿体DNA分析技术研究板栗资源取得了重要进展。作者介绍了叶绿体基因组的结构特点、几种叶绿体DNA标记技术的原理及其在板栗中的应用进展，为板栗资源的进一步保护和可持续利用提供参考。一、叶绿体基因组序列的特点叶绿体DNA（chlproplast DNA.cpDNA）于1962年在藻类中发现。大多数植物的cpDNA是闭环双链DNA，原核的，大小为120-220 kb。包含两个反向重复序列（Inverted Repeat Sequence，IR）、大单拷贝区（Large single-copy Region，LSC）和小单拷贝区（Small single-copy Region，SSC），约22-25 kb长度）。近年来，许多植物分子系统学和遗传分析研究都是基于coDNA的比较分析，因为叶绿体基因组序列具有以下特点和优点：首先，cpDNA分子量小、拷贝数多、结构简单，有利于叶绿体基因组序列的分析。到叶绿体基因组。分析。其次，与包含许多重复序列的核基因组和经常经历重排事件的线粒体基因组不同，叶绿体基因相当保守。突变类型主要是点突变、碱基插入或缺失，平均进化速率约为每年每个位点0.2-1.0109个，仅为核基因的1/3。叶绿体非编码区的DNA进化速率一般高于编码区序列，可应用于不同分类水平的系统发育进化。第三，cpDNA单性遗传具有独立的进化路线，可以不依赖任何其他数据构建分子系统发育树，可以为从历史和系统发育角度解释生物多样性提供可靠和准确的信息。 2、cpDNA的PCR-RFLP分析技术在细胞质基因组分析中，基于PCR的RFLP分析方法揭示的多态性比RFLP技术更丰富，结论更可靠。因此，cpDNA的PCR-RFLP分析已成为叶绿体DNA系统研究中应用最广泛的技术，也是遗传多样性研究、物种鉴定、杂种鉴定等研究领域的有力工具。 PCR-RFLP主要用于碱基变异分析和比较。首先用叶绿体保守引物扩增特定片段，然后用某种限制性内切酶消化。单碱基突变或序列重排的发生可以增加某种限制性内切酶的切割位点。减少或消失，导致限制性内切酶片段长度发生变化，产生限制性片段长度多态性。

在PCR-RFLP分析中，最关键的是叶绿体引物的开发和选择，目前已陆续报道了大量叶绿体PCR引物。其中一些引物已成功跨物种使用，从而发展成为通用引物。通用引物的使用为遗传背景不清楚的叶绿体DNA的研究提供了极大的便利。在壳斗科植物中，Magni 等人。等对红栎的cpDNA 多样性进行了PCR-RFLP 分析，并与其他壳斗科植物进行了比较。结果表明，具有共同生活史的三个物种之间存在很大差异。维托里等人。对意大利山毛榉(Fogus sylvatica) 种群的cpDNA 进行了PCR-RFLP 分析。结果表明，山毛榉cpDNA中存在显着的突变标记，可用于细分意大利山毛榉自然种群，并且研究证明意大利南部山毛榉种群变异性最高。在板栗植物中，Fineschi 等人。等对38个欧洲板栗居群的叶绿体进行了PCR-RFLP分析，检测出11种叶绿体单倍型（haplotype），证明cpDNA的遗传多样性与地域关系并无密切关系，这些欧洲板栗居群所表现出的种内多态性可能与千百年来受到人类活动的影响。 3 DNA杂交技术叶绿体DNA杂交技术是指利用限制性内切酶消化总DNA，将凝胶电泳后分离的DNA片段转移到尼龙膜上，用同位素或生物素标记探针（异源或同源）叶绿体基因片段）进行杂交，最后比较杂交条带的差异。该技术可用于研究植物类群、遗传多样性、分类学和系统发育之间的关系。它是基于不同来源的基因片段部分同源的原理，变性、熔化后的互补DNA重新折叠成为异源双链体的过程。该标记技术为了获得理想的实验结果，常使用同位素标记探针，需要提取大量的总DNA，实验周期长；而且，由于叶绿体基因高度保守，不易发生基因重排等，利用大同源片段的杂交很难在较低分类水平上检测变异类型，从而限制了该技术在板栗植物中的应用。迄今为止，尚未见利用异源叶绿体探针研究板栗资源的报道。 4 COSSR技术叶绿体简单序列重复（cpSSR）标记是近年来新发展起来的分子标记。由Powell等人首先提出，并在松树中筛选出第一批cpSSR引物。 CpSSR的原理与核基因组SSR相同。他们都使用简单的重复序列作为基序，并根据基序两端的保守序列设计用于扩增的引物。由于简单序列重复次数的差异而显示出多态性。叶绿体基因组中的微卫星序列可作为通用标记来估计植物种群的遗传结构、遗传资源的多样性以及研究质体的遗传。由于cpSSR标记技术兼具SSR标记的优点和叶绿体基因组的特点，操作简单，能够揭示多态性

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